골격근 간질성 세포외 소포체의 효소 분리

요약

이 프로토콜은 기계적 분리, 효소 해리, 여과 및 차등 초원심분리를 통해 설치류 근육 조직에서 골격근 간질성 세포외 소포체(SkM-EV)를 분리하고 정제하는 것을 목표로 합니다. 일관성과 신뢰성을 보여줍니다. 분리된 SkM-EV는 근육 항상성 및 질병에 대한 통찰력을 제공하며, 진단 바이오마커 또는 치료 수단으로 응용될 수 있습니다.

초록

세포외 소포체(EV)는 세포 간 통신을 위해 단백질, RNA 및 DNA와 같은 생체 활성 화물을 운반하기 위해 세포에서 방출되는 지질 이중층으로 둘러싸인 나노 입자입니다. 근육 항상성 및 질병에서 세포 간의 EV 매개 누화를 조사하는 것은 근육 발달, 재생 및 위축에 대한 이해를 높일 수 있는 상당한 잠재력을 제공합니다. 그러나 골격근 유래 EV(SkM-EV)를 분리하기 위한 현재 프로토콜은 주로 세포막을 손상시키지 않고 근육 조직에서 EV를 방출하는 데 어려움이 있기 때문에 높은 순도와 수율을 달성하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 이 기사에서는 기계적 분리, 효소 분리, 여과 및 초원심분리로 구성된 SkM-EV 분리를 위한 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 이러한 단계는 근육 조직에서 EV 방출을 향상시키도록 최적화되어 고순도 SkM-EV를 생성합니다. 그 후, 나노 유세포 분석, BCA 분석 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 분리된 SkM-EV의 양과 품질을 특성화합니다. 이 프로토콜은 기초 연구, 질병 진단 및 약물 전달을 발전시키기 위한 조직 유래 EV를 얻을 수 있는 신뢰할 수 있는 플랫폼을 구축할 수 있는 가능성을 제공합니다.

서문

세포외 소포체(EV)는 세포가 세포외 환경으로 방출하는 나노 크기의 막 결합 입자입니다. 이 EV는 핵산, 단백질 및 지질을 전달하여 수용 세포의 흡수 시 여러 신호 전달 경로를 조절합니다. 구체적으로, 골격근(SkM-EV)에서 분리된 EV는 근육 조절 microRNA 또는 전사 인자 1,2,3,4를 전달하여 근육 퇴행, 재생 및 성장에 관여했습니다. SkM-EV 하위집단 및 특성에 대한 이해가 계속 발전함에 따라 이러한 소포는 조기 진단을 위한 바이오마커 ^5,6 및 신경근 질환의 치료 표적으로서 가능성을 보여주고 있습니다. 이 확장 분야는 병리학 연구와 임상 응용 분야 모두에 흥미로운 기회를 제공합니다.

SkM-EV에 대한 현재 연구는 주로 체외 ^{배양 2,7,8}

프로토콜

이 프로토콜은 기계적 분리, 효소 해리, 여과 및 차등 초원심분리를 사용하여 골격근 조직에서 세포외 소포체(EV)를 분리합니다. 이를 통해 경골 전방(TA), 장신근 신전(EDL), 가자미암(SOL), 비복근(GAS) 및 대퇴사두근(QUA)을 포함한 개별 또는 결합된 설치류 사지 근육 그룹에서 EV를 격리할 수 있습니다. 동물 사용은 조지아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며, 이 연구는 연구에서 동물의 관리 및 사용에 대한 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 지침을 준수했습니다. 동물들은 조지아 대학의 동물 및 유제품 과학과 내의 동물 시설에 수용되었습니다. 이 연구에서는 야생형(C57BL/6J) 성체 수컷 마우스를 사용하였으며, 생후 3개월에 희생된 마우스에서 조직을 채취하였다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.

1. 마우스에서 근육 그룹의 기계적 분리

1. CO2로 마우스를 안락사시킨 다음 자궁경부 탈구를 수행합....

결과

이 프로토콜에 따라 야생형 마우스의 전경골(TA), 장신근(EDL), 가자미암(SOL), 비복근(GAS) 및 대퇴사두근(QUA)을 포함한 다양한 근육 그룹에서 골격근 세포외 소포체(SkM-EV)를 성공적으로 추출했습니다. 이러한 SkM-EV의 후속 특성 분석은 나노 유세포 분석을 통해 수행되었으며, 표 1에 요약된 바와 같이 고유한 특징을 규명했습니다. 놀랍게도, 단 1g의 근육 조직에서 .......

토론

이 프로토콜은 마우스에서 뒷다리 근육 그룹을 해부하거나 사용 가능한 프로토콜¹⁶에 따라 사후 인간 근육 조직을 획득하는 것으로 시작됩니다. 다음 골격근 세포외 소포체(SkM-EV) 분리 절차는 간질성 SkM-EV를 방출하기 위한 조직의 경미한 효소 소화, 여과 및 저속 원심분리, 초원심분리의 세 가지 주요 섹션으로 구성됩니다. 마지막으로, 분리된 SkM-EV를 프.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL microcentrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	05-408-120
1.5 mL micro tube (C)	Eppendorf	5720411009
1.5 mL microcentrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	3448	Clear, graduated, nonsterile
BD 5 mL Syringe	Becton Dickinson	14-827-52	luer-lok tip
Cell Counting Slides, Dual Chamber for Cell Counter	Bio-Rad	145-0011
Centrifuge 5430R	Eppendorf	22620667
Cleaning solution	NanoFCM Inc.
Collagenase II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
DPBS (10x) Liquid (-calcium,-magnesium)	Cytiva	SH30378.02	Final used dilution is 1x
DPBS/Modified (1x)	Cytiva	SH30264.02
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Genesee Scientific	25-500
E-POD Pure Water Remote Dispenser	Millipore Sigma	ZRXSP0D01
FA-45-30-11 Microcentrifuge Rotor	Eppendorf	05-401-503
Fisher Vortex Genie 2	ThermoFisher Scientific	12-812
Flow NanoAnalyzer	NanoFCM Inc.
Heratherm OGS60 General Protocol Oven	ThermoFisher Scientific	51028112	Gravity convection, 2.3 cu.ft. 120 V
MemGlow-488 Probe	Cytoskeleton Inc.	MG01-02
Millipak Special Millipore	Millipore Sigma	TANKMPK02
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Rainin	17014392
Pipette tips ER LTS 1000µL F 768G/8	Rainin	30808038
Pipette tips ER LTS 20µL F 960G/10	Rainin	30807966
Pipette tips ER LTS 200µL F 960G/10	Rainin	30807967
Quality Control beads	NanoFCM Inc.
S110-AT Fixed Angle Rotor	ThermoFisher Scientific	45539	1,10,000 rpm
S16 exo 65-155nm beads	NanoFCM Inc.
Scissors	SPI, USA
Sorvall mX 150+ Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher Scientific	50135641
TC 20 automated cell counter	Bio-Rad	1450102
Trypan Blue Solution	Corning	25-900-CI
Tweezers	SPI, USA
VWR 15mL centrifuge tubes	Avantor	89039-668
Whatman Puradisc 13 Filters	Cytiva	6782-1304	0.45 µm pore size
Wild-type C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	stock #000664