우리는 실험의 설정에 루르드 델타 Arrueta Antequera (곤충학학과, 오하이오 주립 대학 / OARDC, 우스터, OH)에서 제공하는 도움말을 인정합니다. 우리는 EAB 애벌레 샘플을 보내 박사 테레사 폴란드 (USDA, 포레스트 서비스, NRS) 감사합니다. 현미경 설치가 평가됩니다 박사와 루이스 카나스 및 Nuris M 아코 스타가 제공하는 데 도움이됩니다. 이 프로젝트에 대한 자금은 오하이오 농업 연구 개발 센터, 오하이오 주립 대학에 appropriated 주 및 연방 기금에 의해 제공되었다.

다른 단계를 완료 프로토콜은 그림 1의 플로우 차트에 그려져 있습니다. 절개를 구성 각 단계는, RNA 추출, 첫 스트랜드 cDNA 합성과 qRT - PCR은 아래 내용입니다. I. 애벌레의 해부 <ol><li> 이 절차의 시작, 장소 에메랄드 애쉬 송곳 또는 EAB, 젖은 티슈에 애벌레하기 전에 해부이 수행되기 전까지는. 신선한 1X 인산염은 절개를 통해 버퍼 추위를 유지하는 얼음, 또는 PBS, 생리 버퍼 유지. </li><li> 시작하려면, 미세 절개 핀과 해부 접시에 EAB 애벌레를 수정. 그 다음 해부 접시에 차가운 1X PBS를 추가합니다. </li><li> 첫째, 해부 가위의 벌금 쌍을 함께 애벌레 목을 벨. 이후 애벌레의 마지막 복부 세그먼트를 제거합니다. </li><li> 포셉의 시계 제조인 쌍을 사용하여 애벌레 시체에서 표피를 리프트. 그런 다음 가위를 사용하여 시체의 길이를 따라 절개합니다. 절개가 만들어으로 파열 창자를 안됩니다. </li><li> 조심스럽게 등 지방 기관 및 결합 조직 등 다른 조직에서 midgut 조직을 분리. 그런 다음, fatbody에 대한 오염이 없다는 것을 보장하기 위해 신선한 1X PBS 버퍼에있는 조직을 씻어. 1.5 ML eppendorf 튜브에 미리 냉장 Trizol 시약 500 μL에 격리​​ midgut을 전송합니다. </li><li> 다음, 집게를 사용하여 지방 신체 조직을 분리하고 냉장 Trizol 시약 500 μL를 포함하는 1.5 ML eppendorf 튜브에 그것을 전송합니다. </li><li> 마지막으로, 조직 무결성을 손상하지 않도록 돌봐 모든 준수 조직을 scrapping하여 애벌레 시체의 표피 조직을 분리. 신선한 PBS 버퍼에 고립 표피 조직을 씻어 차게 Trizol 시약 500 μL와 1.5 ML eppendorf 튜브에 전송할 수 있습니다. </li><li> 절연 지방 몸, 표피 및 midgut 조직은 -80에 저장할 수 있습니다 ° C까지 RNA 추출은. </li><li> RNA 추출을위한 준비에서 발달 단계에 따라 다양한 EAB 샘플을 정렬합니다. 이러한 단계가 1 일, 2 -, 3 -,, 4 - instars, prepupae과 성인을 포함합니다. </li></ol> II. RNA 추출 (Trizol 시약을 사용하는 제조 업체마다의 프로토콜로) 균질화 <ol><li> RNA 추출을 시작하려면 먼저 Trizol 포함 1.5 ML eppendorf 튜브에 조직을 균질로 플라스틱 pestles를 사용합니다. 균질 후, Trizol 시약 각 샘플의 to1 ML의 전체 볼륨을 가지고. </li><li> 발달 단계에 대한, 박격포와 유봉과 액체 질소로 전체 동물을 균질. 다음 Trizol 1 ML에 homogenate의 나누어지는 (50 μg)을 추가합니다. </li></ol> 단계 분리 : <ol start="3"><li> 실온에서 15 분 동안 한 ML의 Trizol로 샘플 튜브를 품어. </li><li> 부화 후, 각각의 튜브에 클로로포름의 200μL를 추가합니다. 즉시 클로로포름을 추가한 후, 약 15 초 동안 적극적으로 튜브를 흔들. 그런 다음, 추가 2~3분을위한 실내 온도에서 튜브를 품어. </li><li> 다음, 2 ° C.에 15 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 원심 분리 후, RNA의 수성 단계있을 것입니다. 수성 단계의 볼륨을 600 μl, 또는 전체 Trizol 볼륨의 60 %되어야합니다. </li></ol> RNA 침전 <ol start="6"><li> 조심스럽게만을 수성 단계를 제거합니다. 수성 단계 아래의 물질의 존재는 압축을 푼 RNA의 오염을 초래하게됩니다. 그런 다음, 적절하게 표시 1.5 ML eppendorf 튜브에 수성 단계를 전송합니다. </li><li> , 수성 단계에서 RNA를 침전 각 튜브에 이소 프로필 알코올의 0.5 ML를 섞어합니다. 10 분 상온에서 샘플을 품어. 부화 후 2 ° C. 10 분 12,000 XG에서 튜브를 원심 분리기 </li></ol> RNA 와시 <ol start="8"><li> 원심 분리 후, 튜브의 표면에 뜨는를 삭제. RNA는 튜브의 아래쪽에 형성 겔형 펠렛에 속해 있습니다. Trizol 1 ML 당 75 % 에탄올의 최소 1 ML 추가, 75 % 에탄올로 펠렛을 씻으십시오. vortexing하여 섞는다. 그런 다음, 2 ° C.에서 5 분 7500Xg에서 튜브를 원심 분리기 </li></ol> RNA 용리 <ol start="9"><li> 튜브의 표면에 뜨는 폐기하십시오. 1 분 작은 테이블 원심 분리기에 다시 튜브를 원심 분리기. 주의 pipetting하여 관에서 초과 뜨는을 제거합니다. 튜브를 열어두고 50~10분을위한 펠릿 공기가 건조 보자. 이것은 크게는 용해도가 감소하므로 위에 펠릿 건조하지 않도록주의하십시오. </li><li> 공기 건조 후의 펠렛 resuspend <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Diethylpyrocarbonate">diethylpyrocarbonate</a> 또는 DEPC, 처리 물. 펠렛을 resuspend하는 데 사용되는 물의 양은 펠렛의 크기에 따라 달라집니다. SM에 대한 DEPC 처리 물의 50 μL를 사용하여큰 펠렛 모든 펠릿 또는 100 μL. 펠렛 완전히 여러 번 다운 피펫 팁을 이동하고하여 DEPC 처리된 물에 용해 보자. </li><li> 펠렛가 해산되면 10 분 동안 55 ° C에서 샘플을 넣으십시오. </li><li> 그런 다음, Nanodrop 분광 광도계 (RNA 샘플 2 μL)를 사용하여 각 RNA 샘플의 농도를 측정합니다. </li><li> -80에서 RNA 샘플을 보관 ° C 이상 사용까지. </li></ol> III. 첫 스트랜드 cDNA 합성 (Invitrogen에서 윗첨자 첫번째 스트랜드 합성 키트를 사용하여 제조 업체마다의 프로토콜로.) <ol><li> 각 RNA 샘플에 대해 PCR 튜브에 다음을 추가 : <table border="0"><tbody><tr><td> RNA </td><td> X μl </td></tr><tr><td> 10mM dNTP 혼합 M </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> Oligo (DT) (0.5 μg / μl) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> DEPC 물을 치료 </td><td> (8 - X) μl </td></tr><tr><td> 총 볼륨 : </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td colspan="2"> 참고 : x는 cDNA 합성에 사용되는 RNA의 볼륨입니다. RNA의 농도에 따라 RNA로부터 2-3 μg 각 반응에 사용되며 각 반응의 총 부피 10 μl해야합니다. </td></tr></tbody></table></li><li> 4 분간 65 thermocycler에 위의 반응 믹스 ° C를 놓습니다. </li><li> theromocyler에서 튜브를 제거하고 최소한 2 분 동안 즉시 얼음에 그들을 놓으십시오. </li><li> 다음을 추가하여 첫 스트랜드 마스터 믹스를 준비 : <table border="0"><tbody><tr><td> 10X RT 버퍼 </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 25mM MgCl 2 </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> 0.1M DTT </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> RNase 아웃 </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table></li><li> RNA 샘플을 포함하는 각각의 튜브, pipeting로 섞어 마스터 믹스 9 μl를 추가하고 혼합 잠시을 원심 분리기. </li><li> thermocycler에 다시 튜브를 삽입하고 42 ° C. 2 분 동안 품어 </li><li> 일시 thermocycler를 각 튜브에 윗첨자 II 반대 transcriptase 효소 (Invitrogen) 1 μl를 추가합니다. 이 단계는 신속하게 완료되어야합니다. </li><li> 1.5 시간 동안 42 ° C에서 샘플을 품어. </li><li> 70 반응 ° C 15 분 동안을 종료할 수 있습니다. </li><li> thermocycler에서 튜브를 제거하고 얼음에 그들을 놓으십시오. </li><li> 각각의 튜브에 RNase H 1 μl를 추가하고 37 thermocycler에 다시 자리 ° C를 20 분. </li><li> thermocycler의 샘플을 복용 후, 각각의 튜브에 nuclease 무료 물을 20 μl를 추가합니다. 각 샘플의 볼륨이 단계에서 두 배가됩니다. </li><li> 샘플 2 μl를 사용하여 각 시료의 농도를 확인합니다. qRT - PCR에 사용하기 위해 20ng/μl의 농도를 만들기 위해 각 샘플의 나누어지는 가져가라. 20ng/μl의 농도에 샘플을 만들어 물의 양은 합성 cDNA의 초기 농도에 따라 달라집니다. </li></ol> IV. qRT - PCR : 참조 유전자의 프라이머 설계 및 결정 <ol><li> 60 ° C와 ~ 100bp의 제품 크기의 녹는 온도 (TM)와 함께 디자인 primers. </li><li> AP - PERI1이 실험에 대한 관심의 유전자로 사용됩니다. 참조 유전자 또는 내부 통제는 데이터의 저장 분석과 정상화를 위해 필요합니다. Ribosomal 단백질 (AP - RP1)은 본 실험에 대한 참조 유전자로 사용됩니다. </li><li> 참조 유전자를 포함하는 데 사용됩니다 primers의 5uM 작업 주식을 준비합니다. </li></ol> 표준의 준비 <ol start="4"><li> 기준하여야한다 사용되는 primers의 효율성을 계산하기 위해서는. </li><li> 테스트하게 될 다양한 샘플로부터 cDNA를 혼합합니다. </li><li> 그래프의 각 원하는 포인트 5 배 시리얼 dilutions하십시오. 네 dilutions 충분해야하지만, 그 다섯도 매우 좋습니다. </li><li> 볼륨 얼마나 많은 지점과 얼마나 많은 기술 복제에서 사용중인 따라 달라집니다. 충분히 참조 유전자를 포함하여 테스트하고 각 유전자에 대한 표준을 만들기 위해이 있어야합니다. </li></ol> 플레이트 템플릿 <ol start="8"><li> qRT - PCR 플레이트의 각 잘 대해 샘플의 이름을 나타내는 템플릿을 디자인합니다. 각 유전자에 대한 기준과 적어도 두 기술은 샘플 당 복제를 포함하는 것을 잊지 말아주세요. </li></ol> 자전거 매개 변수를 설정 <ol start="9"><li> 에 qRT - PCR 기계를 켜고 자전거 매개 변수를 입력합니다. 다음과 같이 실험 자전거 매개 변수는 다음과 같습니다 1 단계 : <ul><li> 1 사이클 : 95 ° C 3 분 </li></ul> 2 단계 : <ul><li> 40주기 : 95 ° C 15 초 60 ° C 30 초 뒤에 (옵션 : 녹는 곡선을 결정하기위한 다음 단계를 포함) </li></uL&gt; 3 단계 : <ul><li> 1 사이클 : 95 ° C 1 분 </li></ul> 4 단계 : <ul><li> 1cycle : 55 ° C 1 분 </li></ul> 5 단계 : <ul><li> 81주기 : 55 ° C 30 초 </li></ul></li></ol> 플레이트는 CFX96 (BioRad) 기계 설정 <ol start="11"><li> 별도의 튜브에서 각 유전자 (참조 유전자를 포함)에 대한 마스터 믹스를 준비합니다. 각 잘 들어, 마스터 혼합으로 구성되어 있습니다 <table border="0"><tbody><tr><td> Nuclease 무료로 물 </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 2.5 X SYBR 녹색 </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> 앞으로 프리머 </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> 프라이머 역방향 </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> 총 부피 </td><td> μl 8 </td></tr></tbody></table></li><li> 준비하는 동안 마스터 믹스 pipetting 오류에 대한 계정을 1-2 여분의 반응을 포함합니다. </li><li> 이전에 설계 템플릿에 따르면, 2 μL를 (20 μL / NG) 각 잘하는 cDNA의 추가할 수 있습니다. 그런 다음, 반응 당 10 μL의 총 볼륨의 결과, 각 잘하는 마스터 믹스 8 μL를 추가합니다. </li><li> 샘플 잘 혼합되어 있는지 확인까지 피펫 아래 (2 배). 어떤 액체가 끝에 숙박 없다는 것을 확인하십시오. 교차 오염을 방지하기 위해 각 샘플에 대한 새 팁을 사용합니다. </li><li> 전체 플레이트가 설치되면 광학 테이프로 번호판을 커버. 그리스의 존재가 읽기에 영향을 미칠 수 있으므로 테이프를 만지지 마십시오. 그런 다음, 우물의 모든 제품 판의 하단에되는 것을 보장하기 위해 1 분 500 RPM에서 번호판을 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 접시의 바닥에 얼음도 물도 없다는 것을 확인하십시오. 마지막으로, qRT - PCR 기계에있는 접시를 놓고 PCR 프로그램을 실행합니다. </li></ol> 실험의 V. 도표 표현 <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : 플로우 차트는 유전자 발현 연구를위한 단계의 순서를 묘사. <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 : 중간에 midgut를 보여주는) 애벌레 EAB의 해부. 애벌레 EAB의 B) 절연의 midgut <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3 : A) 표피 (잘라내기), midgut (MG) ​​및 지방 단체 (FB)를 포함해 다른 애벌레 조직에 peritrophin 유전자 (AP - PERI1)에 대한 상대적인 표현 값 (REVs) 의미합니다. EAB 특정 ribosomal 단백질은 (이하라는, AP - RP1) 관심의 유전자, AP - PERI1에 대해 얻은 데이터를 정규화에 대한 내부 통제로 사용되었다. 애벌레 조직에서 AP - PERI1의 B) 상대 배 변경할 수 있습니다. 표피 조직은 최소한 표현을 보여주 따라서 캘리 브 레이터 (1X) 샘플 (Pfaffl, 2001)로 찍은 거죠. <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4 : A) 애벌레 instars (제 1, 2, 3, 4), prepupae (PP)와 성인 (A)를 포함한 EAB의 다른 발달 단계에 peritrophin 유전자 (AP - PERI1)에 대한 상대적인 표현 값 (REVs) 의미합니다. EAB 특정 ribosomal 단백질 (AP - RP1)이 관심의 유전자, AP - PERI1에 대해 얻은 데이터를 정규화에 대한 내부 통제로 사용되었다. 다양한 발달 단계에서 AP - PERI1의 B) 상대 배 변경할 수 있습니다. PP 샘플은 mRNA 수준의 최소 수준을 보여주 따라서 캘리 브 레이터 (1X 샘플)로 찍은 거죠. VI. 결론 정량 실시간 PCR (qRT - PCR)은 다른 곤충의 조직 및 발달 단계에서 mRNA 수준을 진단하는 효과적인 도구입니다. 또한, qRT - PCR은 대부분 같은 microarrays 및 차세대 RNA - Seq으로 높은 처리량 유전자 발현 분석에서 생성된 데이터의 유효성을 검사하는 핵심 도구를했습니다.

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	<li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritrophic+matrix+structure+and+function.">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li><li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly,+Mayetiola+destructor+[Say].">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li><li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol.">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li><li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li><li>Tellam, R. L., Lehane, M. J., Billingsley, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of the Insect Midgut. , 86-114 (1996).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

임계값주기 (CT)이 값은 qRT - PCR 플레이트의 각 샘플에 대해 얻을 수 있습니다. 표준 곡선을 만들기위한 각 희석에 대해 얻은 CT 값은 그 농도의 로그 역모를 꾸몄다했다. 실험 샘플에 대한 CT 값은 다음이 희석 시리즈 표준 곡선에 꾸몄다했다. 목표 수량은 각 실험 즉, 조직 발달 표현에 대해 생성된 별도의 표준 곡선으로부터 계산되었다. 상대 표현식 값 (REVs) 다음 내부 통제를 위해 얻은 수량 (AP ...

analysis of gene expression in emerald ash borer (agrilus planipennis) using quantitative real time-pcr

에메랄드 애쉬 송곳 (EAB,<em&gt; Agrilus planipennis</em&gt;)하면 애쉬 나무의 수백만을 죽인이있는 이국적인 침입 해충 (수 있습니다<em&gt; Fraxinus</em&gt; 종) 북미 인치<strong&gt;</strong&gt; EAB는 빠른 속도로 확산 계속해서 공격은 성숙 나무 묘목에서 다른 연령층의 나무 재가. 그러나, 거의 날짜 또는 어떤 분자 지식 EAB을 위해 존재하지. 우리는 조직 수준에서 분자 기반의 생리 과정을 해독에 관심이있다 애쉬 나무의 성공적인 식민지의 원조 EAB. 이 보고서에서 우리는 다른 애벌레 티슈 (midgut, 지방 기관 및 표피 포함) 및 다른 발달 단계 (1과 같은 확인할 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR의 효과적인 사용 (qRT - PCR)을 표시<sup&gt; 일</sup&gt; - 2<sup&gt; 차</sup&gt; - 3<sup&gt; 차</sup&gt; - 4<sup&gt; 일</supEAB의&gt; - instars, prepupae 어른). 예를 들어, peritrophin 유전자 (이하라는,<em&gt; AP - PERI1</em&gt;)는 관심의 유전자와 ribosomal 단백질 (로 exemplified입니다<em&gt; AP - RP1</em&gt;) 내부 통제로. Peritrophins은 곤충 장의 내벽입니다 peritrophic 멤브레인 / 매트릭스 (PM)의 중요한 구성 요소입니다. PM은 소화 및 midgut의 상피에 기계적 보호 등 다양한 기능이 있습니다.

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Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

정량 실시간 PCR (qRT - PCR)은 다른 곤충의 조직 및 발달 단계에서 mRNA 수준을 진단하는 효과적인 도구입니다. 이 보고서에서 우리는 다른 애벌레 조직에서 확인할 mRNA 레벨 및 침입 곤충의 종, 에메랄드 애쉬 송곳의 발달 단계에 qRT - PCR의 사용을 보여줍니다.

에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

10.6K 조회수.  The Ohio State University. 정량 실시간 PCR (qRT - PCR)은 다른 곤충의 조직 및 발달 단계에서 mRNA 수준을 진단하는 효과적인 도구입니다. 이 보고서에서 우리는 다른 애벌레 조직에서 확인할 mRNA 레벨 및 침입 곤충의 종, 에메랄드 애쉬 송곳의 발달 단계에 qRT - PCR의 사용을 보여줍니다.

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Microarrays을 사용하여 세균의 유전자 발현 분석

연구

생물학

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

써모 과학 솔라리스 qPCR 어세를 사용하여 정량 실시간 PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...