Fresh Primary Tumor Tissue Processing to Establish Tumor Organoids and Primary Fibroblasts

조직을 멸균 조직 배양 플레이트에 넣고 과도한 배지를 제거하는 것으로 시작합니다. 멸균 금속 자로 조직을 측정하고 사진을 찍습니다. 절단된 티슈에 고급 DMEM/F-12 배지 3mL를 넣고 티슈를 위아래로 피펫팅하여 세척합니다.

그런 다음 PBS 3ml로 티슈를 씻으십시오. 조직 배양 플레이트에서 배지를 흡인하고 멸균 블레이드와 2mL의 분해 배지를 사용하여 작은 조각으로 자릅니다. 그런 다음 조직을 총 5ml의 소화 배지를 포함하는 50mL 튜브에 수집합니다.

튜브를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 위아래로 피펫팅하여 서스펜션을 주기적으로 혼합합니다. 튜브에 5mL의 고급 DMEM/F-12를 추가하여 트립신을 비활성화합니다.

그런 다음 70마이크로미터 기공 스트레이너를 통해 샘플을 여과하여 큰 파편을 제거합니다. 이제 10%FBS가 포함된 2밀리리터의 DMEM을 필터 상단에 피펫팅하고 피펫을 사용하여 섬유아세포 배양을 위한 파편과 조직 잔여물을 수집합니다. 그런 다음 섬유아세포 배양을 위해 파편을 도금합니다.

실온에서 200 내지 300 G의 여액을 5분간 원심분리한 후, 상층액을 흡인한다. 펠릿에 5ml의 고급 DMF 12를 추가하고 현탁액을 300G에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 적혈구 용해의 경우 펠릿을 염화암모늄 칼륨 용해 완충액 4밀리리터에 재현탁시키고 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.

실온에서 2분 동안 세포를 배양합니다. 이전에 설명한 것과 동일한 조건에서 혼합물을 원심분리한 후 상층액을 흡인합니다. 펠릿에 5밀리리터의 고급 DMEM/F-12를 넣고 섭씨 4도에서 다시 원심분리합니다.

상층액을 흡인한 후 시판되는 세포 해리 시약 1m리터를 펠릿에 첨가하고 실온에서 2-3분 동안 배양합니다. 배양 후 상층액을 다시 한 번 원심분리하고 흡인합니다. 그런 다음 펠릿을 5밀리리터의 고급 DMEM/F-12에 재현탁시킵니다.

P1000 피펫으로 현탁액을 여러 번 피펫팅하여 세포 덩어리를 분리합니다. 현탁액을 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 다음으로, 사전 냉각된 P1000 및 P200 피펫 팁을 구하고 P1000 피펫에 고정된 콜드 팁을 사용하여 멤브레인 매트릭스에 세포 펠릿을 재현탁시킨 후 Falcon을 얼음 위에 올려 응고를 방지합니다.

인큐베이터에서 예열된 플레이트를 얻습니다. 48마이크로리터로 설정된 P200 피펫을 사용하고 콜드 팁을 사용하여 예열된 플레이트에 기저막 매트릭스 돔을 생성합니다. 그런 다음 배양하여 기저막 혼합물을 응고시킵니다.

매트릭스가 응고되면 성장 인자와 억제제를 보충한 고급 DMEM/F-12 2-2.5밀리리터를 추가합니다. 종양 세포를 분리하고 15일 동안 신선한 조직에서 종양 오가노이드를 확립했습니다. 때때로, 큰 세포 파편 부피는 발달 중인 종양 오가노이드의 정확한 시각화를 방해합니다.

발달 중인 오가노이드는 종양 기원에 따라 분리된 배양, 둥근 배양에서 스페로이드 또는 응집체 유사 배양에 이르기까지 표현형적으로 다양한 것으로 관찰되었습니다. 오가노이드 배양은 원발성 종양 세포 배양의 일반적인 PI 산물인 섬유아세포에 의해 오염될 수 있습니다. 약 7일간의 배양 후 섬유아세포는 기저막 매트릭스 돔에서 이동하여 세포판에 달라붙어 최적의 오가노이드 성장을 저해할 수 있습니다.

섬유아세포 배양은 필터에서 회수된 조직 파편에서 확립됩니다. 세포는 조직 파편에서 이동하여 배양판에 부착됩니다.