ChP Specific Knockdown of A2ARs with AAV2/5-shRNA and Cre/LoxP System

시작하려면 마취된 쥐를 수술 플랫폼에 놓습니다. 머리카락을 다듬은 후 양쪽 눈 아래에 눈 연고를 발라 건조하지 않도록 합니다. 그런 다음 고정을 위해 쥐를 입체 장치에 고정합니다.

두개골이 완전히 노출되도록 현미경으로 작게 절개합니다. AAV2/5-아데노신 2A 수용체 shRNA를 포함하는 주사기 2개와 AAV2/5 스크램블을 포함하는 주사기 2개를 준비합니다. 그런 다음 현미경을 사용하여 브레그마와 람다를 찾고 쥐 뇌 입체 아틀라스를 기반으로 10마이크로리터 주사기의 좌표 점을 설정합니다.

설정된 좌표 지점에서 두개골에 작은 구멍을 뚫습니다. AAV2/5-아데노신 2A 수용체 shRNA 바이러스 2마이크로리터를 분당 100나노리터의 일정한 속도로 측면 주입을 통해 뇌실에 주입합니다. 빼기 전에 바늘을 10분 동안 제자리에 두십시오.

바이러스 손실을 방지하기 위해 의료용 바이오 피브린 접착제를 사용하여 손상된 피부를 즉시 밀봉하십시오. 마우스를 가열 패드에 놓고 체온을 약 섭씨 37도로 유지하여 회복을 용이하게 합니다. 실험군의 경우 Arosa L-D-L-T-D 토마토 마우스의 각 외측 심실에 2마이크로리터의 CRE-TAT 재조합효소를 주입하고 대조군의 경우 2마이크로리터의 멸균 PBS를 주입합니다.

CRE-TAT 재조합효소 주입 2주 후, 냉동 조직 절편을 준비하고, 핵 염색을 수행하고, 이미징을 위한 슬라이드를 준비합니다 CRE-TAT를 사용하여 동형접합 아데노신 2A 수용체 플럭스 마우스의 맥락총에서 아데노신 2A 수용체를 녹다운하면 EAE 임상 점수가 감소했습니다. 마찬가지로, AAV2/5 shRNA를 사용하여 아데노신 2A 수용체 야생형 마우스에서 맥락총(choroid plexus)을 녹다운하면 EAE 임상 점수가 감소했습니다. QPCR 분석 결과, AAV2/5 shRNA 및 CRE-TAT 투여군에서 아데노신 2A 수용체의 mRNA 수치가 각 대조군에 비해 감소한 것으로 나타났다.

특히 맥락총에 있는 아데노신 2A 수용체를 침묵시키면 척수로의 면역 세포 침투가 감소합니다.