Testing the Polarized State of Mitochondria to Analyze the Ion Channel Function in Cancer Cells

시작하려면 75제곱센티미터 배양 플라스크에 세포를 유지합니다. 배양 배지를 흡인하고 칼슘과 마그네슘 없이 PBS로 세포를 헹굽니다. 다음으로, 0.25% 트립신 EDTA 2밀리리터를 첨가하여 부착 세포를 분리합니다.

실온에서 5 분 동안 배양하고 10 밀리리터의 배지에서 세포를 재현탁한다. 다음으로, 플라스크에서 15밀리리터 원심분리기 튜브로 세포를 수집합니다. 실온에서 5분 동안 480G에서 원심분리하고 배지를 흡인합니다.

배양의 원래 밀도에 따라 5 내지 10 밀리리터의 배지에서 세포를 재현탁한다. 100 마이크로 리터의 세포를 제거하고 1.5 마이크로 리터의 0.4 % 트리 판 블루가있는 0.4 밀리리터 튜브에 추가합니다. 세포를 혈구계에 추가하고 현미경으로 관찰하고 수동 집계 계수기를 사용하여 세포를 계산합니다.

세포를 페놀 레드가 없는 배양액에서 밀리리터당 10 내지 4배로 3배 희석한다. 2.5 밀리리터의 세포 현탁액을 제조자의 지시에 따라 폴리-D-라이신-코팅된 커버 슬립이 있는 6-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 하룻밤 동안 세포를 성장시켜 커버 슬립에 세포를 부착할 수 있도록 합니다.

다음날 20X 대물렌즈를 사용하여 도립 현미경으로 세포 부착을 검사합니다. 원하는 농도로 처리 원액을 준비하고, 매질-전용 대조군, 시험 화합물과 일치하는 농도의 비히클-단독 대조군, 및 이오노포어 FCCP 및 시험 화합물을 갖는 대조군을 생성한다. 한 번에 하나의 커버 슬립으로 작업하면서 연구 조건에 대한 1.8 밀리리터의 배지를 세포에 첨가하십시오.

섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 대조군 또는 시험 화합물로 처리된 세포를 원하는 시간 동안 가습 환경에서 배양합니다. 처리 기간 후, 200 마이크로리터의 10X TMRE를 세포에 첨가한다. 5% 이산화탄소 가습 환경에서 섭씨 37도에서 15-30분 동안 배양합니다.

배지를 부드럽게 흡인하고 PBS로 세포를 두 번 헹구어 배경 간섭을 최소화합니다. 그런 다음 커버 슬립을 치료 조건이 표시된 현미경 슬라이드에 뒤집습니다. 세포가 549 나노 미터 여기와 575 나노 미터 방출로 살아 있다고 이미지화하십시오.

컨포칼 현미경을 활용하여 세포 무결성이 손실되기 전에 고속 이미지 캡처로 여러 Z 스택 필드를 캡처할 수 있습니다. 나중에 분석할 수 있도록 이미지 파일을 저장하고 저장합니다. 활성 미토콘드리아를 가진 세포는 TMRE 염색을 유지하고 높은 형광을 보였다.

탈분극되거나 비활성 미토콘드리아는 막 전위가 감소하고 TMRE를 유지하지 못하며 낮은 형광 신호를 나타냅니다.