실험 전에 모든 시약을 준비하고 기저막 매트릭스를 얼음 위에서 해동하는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 쥐 단층 배지를 준비하십시오. 해동된 기저막을 차가운 쥐 단층 배지로 1에서 20까지 희석하고 얼음 위에 보관하십시오.
멸균 겸자를 사용하여 0.4마이크로미터 투명 세포 배양 삽입물을 24웰 조직 배양 플레이트의 단일 웰에 넣습니다. 인서트의 모서리 갈래를 잡고 우물로 옮깁니다. 적절한 수의 세포 배양 삽입물을 배양에 사용할 수 있을 때까지 반복합니다.
희석된 기저막 매트릭스로 각 세포 배양 삽입물의 정점 표면을 덮으려면 P 200 피펫의 끝을 삽입물 중앙에 놓고 150마이크로리터 매트릭스를 배출합니다. 그런 다음 플레이트를 5% 이산화탄소가 포함된 멸균 37도 인큐베이터에 최소 1시간 동안 옮깁니다. 배양이 끝나면 24웰 플레이트를 45도 각도로 회전시킵니다.
인서트를 고정하기 위해 프롱 모서리에 한 손가락을 놓습니다. P 200 피펫 팁을 인서트의 바닥면을 따라 부드럽게 놓고 베이스 매트릭스를 제거합니다. 칼슘 또는 마그네슘 이온이 없는 150마이크로리터의 멸균 DPBS로 각 세포 배양 삽입물을 세척하여 초과 잔류물을 제거하고 생물학적 안전 캐비닛에서 최소 10분 동안 건조시킵니다.
삽입물이 건조되면 400 마이크로 리터의 쥐 단층 배지를 바닥에 추가하고 75 마이크로 리터를 세포 배양 삽입물 위에 추가합니다. 모든 세포 배양 삽입물이 잠길 때까지 반복합니다. 필요할 때까지 플레이트를 생물학적 안전 캐비닛이나 인큐베이터에 두십시오.
그런 다음 인큐베이터에서 성숙한 장 콜로노이드의 24웰 플레이트를 제거하고 생물학적 안전 캐비닛 아래에 놓습니다. 멸균 팁을 사용하여 배지를 흡인하고 실온에서 1밀리리터의 멸균 DPBS로 각 웰을 세척합니다. 멸균 팁을 사용하여 칼슘 또는 마그네슘 이온 없이 DPBS를 제거합니다.
계대할 각 웰에 500 마이크로리터의 효소 해리 시약을 첨가하여 기저막 매트릭스의 각 플러그를 분해합니다. 플러그를 끊으려면 24웰 플레이트를 45도 각도로 돌립니다. 피펫의 끝 부분을 플러그 가장자리에 놓고 각 플러그를 약 6-10회 피펫팅하여 부드럽게 빼냅니다.
24웰 플레이트를 5% 이산화탄소가 함유된 37도의 멸균 인큐베이터에 3-4분 동안 다시 넣습니다. 배양 후, 생물학적 안전 캐비닛 아래의 각 웰에 대해 트립신을 5-7회 위아래로 피펫팅합니다. 해리 된 콜로노이드를 각 웰에서 멸균 된 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 얼음처럼 차가운 마우스 세척 배지로 최대 10 밀리리터의 부피를 가져옵니다.
다음으로, 스윙 버킷 원심분리기에서 섭씨 4도에서 5분 동안 300G에서 부분적으로 분해된 콜로노이드를 원심분리합니다. 생물학적 안전 캐비닛 아래에서 10 밀리리터 피펫을 사용하여 펠릿에서 상청액을 제거합니다. 또한 P 200 피펫을 사용하여 남아 있는 배지를 제거합니다.
그런 다음 75 마이크로 리터의 쥐 단층 배지를 추가하여 콜로노이드 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 75 마이크로리터의 콜로노이드 현탁액을 각 세포 배양 삽입물의 중앙에 분배합니다. 균일한 도금을 보장하기 위해 웰에 추가하기 전에 현탁액을 한두 번 부드럽게 피펫팅합니다.
5% 이산화탄소 인큐베이터의 멸균 섭씨 37도에 플레이트를 넣기 전에 세포 배양 삽입물 전체에 균일하게 분산될 수 있도록 세포 배양 삽입물이 있는 24웰 플레이트를 회전 플랫폼에 10분 동안 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, 팁을 세포 배양물의 내부와 나란히 배치하고 배지를 P 200 피펫으로 3 내지 5회 피펫팅하여 부착되지 않은 콜로노이드 단편을 제거하였다. 부착 된 장 세포를 방해하지 마십시오.
배지와 콜로노이드 혼합물을 즉시 제거하십시오. 모든 세포 배양 삽입물이 세척될 때까지 반복합니다. 이제 150 마이크로 리터의 미리 데워진 쥐 단층 배지를 각 세포 배양 삽입물의 정점면에 추가합니다.
400 마이크로리터의 따뜻해진 쥐 단층 배지를 새로운 24 웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 멸균 집게를 사용하여 갈래를 잡아 세포 배양 삽입물을 새 플레이트로 옮깁니다. 원하는 밀도에 도달할 때까지 격일로 매체를 교체하십시오.
세포 배양 삽입물 상에 도말된 효소적으로 파괴된 콜로노이드는 초기에 15 내지 150 세포 범위의 세포 클러스터에서 나타났다. 3일째 되는 날, 세포는 평평해지고 세포 배양 삽입물을 천천히 덮어 일반적으로 합류도에 도달했습니다. 다음 며칠 동안 단층은 계속 성장하여 정량적으로 측정할 수 있는 지속적인 장벽을 형성했습니다.
