시작하기 전에 활막 섬유아세포 분리를 수행하고 이 절차에서 콜라겐 코팅 접시에서 수집한 비부착성 세포를 사용합니다. 콜라겐으로 코팅되지 않은 40 내지 60 밀리미터 접시에 비부착성 세포를 시딩한다. 벌크 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 가습된 분위기에서 하루 동안 배양합니다.
비부착성 림프구를 제거하려면 배양된 배지를 흡인한 다음 새로운 배양 배지를 추가합니다. 합류를 유지하면서 2일마다 배지를 교체하면서 부착된 벌크 세포를 1-2주 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS 또는 HBSS로 두 번 씻으십시오.
HBSS에서 0.05% 트립신으로 처리하여 활막 대식세포를 선택하고 5% 이산화탄소로 가습된 분위기에서 섭씨 37도에서 3분 동안 배양합니다. 그런 다음 배양 배지를 HBSS의 0.05% 트립신에 부드럽게 추가합니다. 이 단계 후에 배지를 세포에 직접 붓지 마십시오.
분리된 세포를 제거하려면 배양된 배지를 흡인한 다음 신선한 배양 배지를 부드럽게 추가합니다. 두세 번 반복하고 사용할 때까지 신선한 배양 배지에서 접시 위의 세포를 유지합니다. 7 내지 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스로부터 대식세포-유사 세포를 분리하고, RT-qPCR에 의해 분석하였다.
범대식세포 마커 CD68, EMR1, ITGAM, CSF1R의 mRNA 발현은 활막염 조직으로부터 풍부한 대식세포 분리를 나타내었다. 대식세포의 순도를 확립하기 위해, 대식세포 및 다른 세포 유형에 대한 표면 단백질 마커를 유세포 분석에 의해 분석하였다. 세포의 90% 이상이 대식세포 마커인 CD45, CD11b 및 F4/80을 발현한 반면, 호중구 마커인 Ly6G와 T 세포 마커인 CD3의 발현은 1% 미만이었습니다
