시작하려면 해동된 액적 디지털 또는 ddPCR 마스터 믹스를 가져와서 실온에서 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 추가합니다. 각 증폭 대상에 대한 마스터 믹스를 준비하여 화면에 표시된 제안된 조성에 따라 필요에 따라 프라이머와 프로브의 농도를 조정합니다. 혼합물을 완전히 소용돌이 치고 미니 원심 분리기에서 간단히 원심 분리합니다.
제한 효소를 넣고 뒤집어 섞습니다. 다음으로, 제조된 마스터 믹스 16.5 마이크로리터를 PCR 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 투명 접착 필름으로 밀봉한다. 샘플 희석 버퍼를 희석액으로 사용하여 품질 관리 또는 검증 정확도 및 정밀 실행을 위한 권장 농도를 나타내는 이 표에 설명된 대로 QC 희석액을 준비합니다.
눈물 샘플을 0.2밀리리터 PCR 튜브에서 1:10 비율로 샘플 희석 버퍼로 희석하고 튜브를 밀봉합니다. 샘플을 열순환기에서 섭씨 95도에서 10분 동안 가열한 다음 섭씨 4도에서 최소 5분 동안 가열합니다. 마스터 믹스를 함유하는 ddPCR 플레이트로부터 접착 필름을 제거하고, 플레이트 맵에 나타낸 바와 같이 96-웰 플레이트의 적절한 웰에 5.5 마이크로리터의 QC 희석액을 첨가한다.
그런 다음 5.5 마이크로 리터의 샘플을 웰에 추가합니다. 5.5마이크로리터의 샘플 희석 버퍼를 템플릿 없음 대조군 또는 NTC 웰에 추가합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 2x ddPCR 버퍼 대조군을 1:2 비율로 희석하고 22마이크로리터의 버퍼를 컬럼의 빈 웰에 추가합니다.
플레이트에 피어싱 가능한 호일 씰을 추가하고 플레이트를 플레이트 실러에 놓습니다. 섭씨 180도에서 5초 동안 플레이트를 밀봉합니다. 플레이트를 최대 속도로 최소 30초 동안 소용돌이치고 플레이트 스피너에서 잠시 원심분리합니다.
Automated Droplet Generator의 터치스크린에서 샘플이 포함된 플레이트 맵의 컬럼을 선택합니다. 기기의 데크에 불이 들어와 필요한 소모품을 나타냅니다. 액적 발생기를 뒤에서 앞으로 로드합니다.
노란색 표시등이 노란색에서 녹색으로 바뀌어 소모품의 충분성을 나타냅니다. 콜드 블록과 물방울 플레이트 홀더를 놓습니다. 블록이 완전히 파란색이고 분홍색이 보이지 않는지 확인합니다.
콜드 블록에 새 96 용접 ddPCR 플레이트를 놓습니다. 준비된 PCR 플레이트를 샘플 플레이트 홀더에 넣습니다. 기계 뚜껑을 닫고 물방울 생성을 위해 시작을 누릅니다.
30분 이내에 콜드 블록에서 물방울이 포함된 플레이트를 제거합니다. 플레이트에 피어싱 가능한 호일 씰을 추가하고 플레이트를 플레이트 실러에 놓습니다. 섭씨 180도에서 5초 동안 밀봉합니다.
그런 다음 플레이트를 호환되는 열 순환기에 놓고 화면에 표시된 순환 조건을 입력합니다. 플레이트를 액적 리더에 로드하여 충분한 리더 오일이 남아 있고 폐기물 용기에 충분한 공간이 있는지 확인합니다. 마지막으로 소프트웨어의 읽기 버튼을 눌러 물방울 읽기를 시작합니다.
각 분석에서 각 농도에 대한 인트라 분석 평균을 계산하고 이를 사용하여 분석의 정밀도와 정확도를 평가했습니다. 7.7%의 평균 분석 간 정밀도와 4.2%의 평균 절대 분석 간 정확도가 모든 QC 수준에서 발견되었습니다. 분석 간 정확도 및 정밀도는 또한 각 배치 내의 각 QC 수준의 분석 간 평균을 사용하여 계산되었습니다.
4에서 8.5 % 범위의 분석 간 정밀도와 1에서 3.2 % 범위의 분석 간 절대 정확도가 발견되었습니다. 유사하게, 눈물 샘플의 경우, 높은 스파이크 수준에서 3.7%, 낮은 스파이크 수준에서 12.2%의 평균 분석 간 정밀도 및 높은 수준에서 11.3%, 낮은 수준에서 8.1%의 평균 분석 간 절대 정확도가 관찰되었습니다. Inter assay 계산의 경우 높은 수준에서 5.5%, 낮은 수준에서 7.1%의 정밀도와 높은 수준에서 11.3%, 낮은 수준에서 8.1%의 절대 정확도를 나타냈다.
