Bleaching and Plating Caenorhabditis elegans P0 Generation Embryos onto RNAi-NGM plates

OP50-1 박테리아가 파종된 35mm 표준 NGM 플레이트에서 3개 또는 4개의 예쁜꼬마선충 성체를 선택하여 RNAi 유전 분석을 위해 동물을 준비합니다. 4일 후, Triton X-100이 보충된 800마이크로리터의 M9 완충액을 사용하여 플레이트에서 회색 성충을 1.5밀리리터 튜브로 씻어냅니다. 세척을 반복하고 벌레를 하나의 튜브로 당깁니다.

1, 1.5 2 분 동안 000 G에 벌레를 분리한 후에, 벌레 펠릿을 교란하기 없이 100 마이크로리터를 남겨두는 상층액을 흡인하십시오. 웜 펠릿이 들어있는 각 튜브에 650 마이크로 리터의 이중 증류수를 첨가하십시오. 수집된 개체군에서 예쁜꼬마선충 배아를 분리하려면 갓 준비한 표백 용액 250마이크로리터를 추가하고 타이머를 시작합니다.

1-2분마다 튜브를 완전히 소용돌이치게 합니다. 5분 후 입체경으로 성충의 분해를 모니터링합니다. 벌레가 완전히 용해되고 배아만 남을 때까지 계속 소용돌이칩니다.

일반적으로 6-7분 정도 걸립니다. 즉각 1, 1.5 분 동안 000 G에 관을 분리하고 배아를 가진 상층액의 대략 50 100 마이크로리터를 남겨두는 상층액을 흡인하. Triton X-100이 보충된 M9 완충액 1밀리리터를 배아와 소용돌이에 추가합니다.

현탁액을 원심분리하고 세척을 두 번 반복합니다. 최종 세척 후 상층액을 흡인하고 튜브에 약 100마이크로리터를 남겨 둡니다. 분리된 배아가 있는 튜브를 소용돌이치게 하고 각 튜브에서 2마이크로리터를 라벨이 부착된 유리 슬라이드에 두 번 피펫팅합니다.

마이크로리터당 배아의 농도를 추정하기 위해 집계 카운터를 사용하여 배아를 계산합니다. 반동기화된 개체군 성장을 시작하려면 약 250개의 배아를 GFP 또는 대조군 RNAi 벡터가 있는 E.coli HT115 박테리아가 포함된 각 RNAi NGM 플레이트에 이식합니다. 액체가 흡수되도록 하십시오.

섭씨 21도에서 4일 동안 RNAi로 처리한 P naught 세대를 배양합니다.