시작하려면 110, 000G 및 섭씨 4도의 초원심분리기에서 FBS를 밤새 원심분리하여 내인성 sEV를 제거합니다. 상층액을 0.2미크론 한외여과막을 통해 여과하여 살균하여 sEV가 없는 FBS를 생성합니다. 다음에, 150 밀리미터 배양 접시에, 20 밀리리터의 DMEM 배양액에 약 3회 10 내지 7회 불멸화된 골수 유래 대식세포를 플레이트한다.
대식세포에서 sEV를 수집하기 전에 하룻밤 동안 5% 이산화탄소 아래에서 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다. 다음날, 배지를 버린 후, 세포를 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 세척하였다. 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 세포를 배양하기 전에 10%sEV가 없는 유리 소 태아 혈청을 포함하는 DMEM으로 배지를 교체합니다.
실험의 요구 사항에 따라 세포의 상청액을 수집하여 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 300G에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 제거합니다. 각 튜브의 상층액 결과를 새로운 50 밀리리터 원심 분리기 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다.
이때, 상층액을 2000 G에서 10분 동안 원심분리하여 죽은 세포를 제거하였다. 그런 다음 상층액을 새 고속 원심분리기 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. 다음으로, 이물질과 미세소포체를 제거하고, 얻어진 상층액을 10, 000 G에서 고속 원심분리기를 이용하여 30분 동안 원심분리한다.
각 튜브에 35 밀리리터를 추가하고 펠릿을 폐기하여 생성 된 상청액을 새로운 초 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 상등액을 버리기 전에 110, 000 G에서 70 분 동안 스윙 버킷 로터 원심 분리기에서 초 원심 분리기 튜브를 원심 분리하십시오. 생성된 조잡한 sEVs 농축 펠릿을 1밀리리터의 PBS로 세척합니다.
다시, 튜브 중 하나에서 세척된 펠릿에 1밀리리터의 PBS를 첨가하고, 연속적으로 피펫팅하여 혼합한다. 생성된 PBS 현탁액 1밀리리터를 펠릿이 들어 있는 다른 튜브로 옮기고 튜브 내의 모든 펠릿이 피펫팅에 의해 혼합될 때까지 동일한 과정을 반복합니다. 그 결과 1밀리리터의 sEV가 풍부한 PBS를 새로운 초원심분리기 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 110, 000 G의 탁상용 초 원심 분리기에서 새 튜브를 70 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 버린 후, 생성된 미정제 sEVs-농축 펠릿을 100 마이크로리터의 PBS로 세척한다. 표준 단백질 튜브에 1.2 밀리리터의 단백질 준비 용액을 첨가하여 그 안에 존재하는 30 밀리그램의 BSA를 용해시킵니다.
생성 된 단백질 표준 용액을 PBS로 희석하여 농도를 밀리리터 당 25에서 0.5 밀리그램으로 감소시킨다. 희석된 단백질 표준 용액의 8가지 다른 부피를 96웰 플레이트의 웰에 추가하고 PBB를 사용하여 각 웰에서 부피를 20마이크로리터로 가져옵니다. 18 마이크로리터의 HEPES 용해 완충액을 샘플 웰에 첨가한 다음, 2 마이크로리터의 sEVs 샘플을 첨가한다.
다음으로, 제조업체의 지침에 따라 준비된 BCA 작업 용액 200 마이크로 리터를 각 웰에 첨가하십시오. 플레이트를 실온에서 20-30분 동안 그대로 두십시오. 마지막으로 마이크로플레이트 리더를 사용하여 562나노미터에서 흡광도를 측정합니다.
얻어진 결과를 이용하여 sEV의 총 단백질 함량을 계산한다. 분리된 sEV의 투과 전자 현미경 이미지는 전형적인 컵 모양의 형태를 나타냈습니다. 나노 입자 추적 분석은 분리 된 sEV가 대부분 136 나노 미터에 집중되어 있음을 보여주었습니다.
웨스턴 블롯은 분리된 sEV가 CD9, 베타-액틴 및 TSG101을 포함한 sEV 마커가 상당히 풍부하다는 것을 보여주었습니다. 소포체 망상 마커 GRP94는 전체 세포 용해물에서만 검출되었습니다. 결과는 사용된 방법이 높은 순도의 sEV를 산출했음을 나타냅니다.
