시작하려면 분리 된 작은 세포 외 소포 또는 SEV를 110, 000 G 및 섭씨 4도에서 70 분 동안 초 원심 분리하여 두 번 세척하십시오. 소포를 500마이크로리터의 인산염 완충 식염수 또는 PBS에 다시 현탁합니다. 그런 다음 5 마이크로 리터의 100X 프로테아제 억제제를 첨가하십시오.
샘플을 40와트에서 10분 동안 초음파 분쇄, 3초의 초음파 시간 및 5초의 간격 시간으로 적용합니다. 분쇄 된 혼합물을 섭씨 4도에서 15 분 동안 13, 700 G에서 원심 분리한다. 얻어진 상청액에 dithiothreitol을 50 밀리몰의 최종 농도로 첨가한다.
그리고 섭씨 56도의 수조에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 50 마이크로 리터의 1 몰 요오도 아세트 아미드를 상청액에 첨가하십시오. 그리고 어두운 곳에서 20분 동안 실온에서 반응시키십시오.
혼합물을 13, 700 G 및 섭씨 4도에서 15 분 동안 원심 분리한다. 그리고 상기 조 펩타이드 추출물을 포함하는 상층액을 10 kilodalton 초원심분리 튜브로 옮긴다. 한외 여과 튜브를 섭씨 13, 700 G 및 섭씨 4도에서 1시간 동안 원심분리하여 조 펩타이드로부터 단백질을 제거한다.
수집된 폐수를 섭씨 45도의 진공 원심 농축기에서 건조시킵니다. 탈염을 위해 질량 분석 등급의 순수한 물을 모든 시약의 용매로 사용하십시오. 먼저, 건조 펩타이드를 0.1% 트리플루오라세트산 또는 TFA 100마이크로리터에 용해시키고 따로 보관합니다.
그런 다음 100마이크로리터의 순수 아세토니트릴을 각 탈염 컬럼에 추가합니다. 실온에서 3분 동안 400G에서 컬럼을 원심분리하고 폐수를 버립니다. 그런 다음 탈염 컬럼당 100마이크로리터의 50% 아세토니트릴을 추가하고 폐수를 버리기 전에 앞에서 언급한 대로 원심분리를 반복합니다.
다음으로, 앞서 언급한 바와 같이 원심분리하기 전에 각 탈염 컬럼에 100마이크로리터의 0.1% TFA를 추가합니다. 다시 한 번, 폐수를 버리십시오. 이제 탈염 펩타이드를 탈염 컬럼에 피펫팅합니다.
앞서 언급한 대로 컬럼을 원심분리하여 샘플을 로드합니다. 회수된 폐수를 탈염 컬럼에 다시 추가하여 로딩을 반복합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 0.1% TFA를 추가합니다.
앞서 언급했듯이 원심 분리하고 폐수를 버립니다. 마지막으로 0.1% TFA를 함유한 50%아세토니트릴 50마이크로리터를 탈염 컬럼의 펩타이드에 추가합니다. 원심 융합 후 앞서 언급했듯이 새로운 질량 분석 등급 원심 분리기 튜브에 폐수를 수집합니다.
