먼저, 폴리(A)농축 RNA의 분리를 위해 10-20마이크로그램의 고품질 total RNA를 준비합니다. RNA 분취액을 뉴클레아제가 없는 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 섭씨 70도의 열 블록에서 5분 동안 배양한 다음 얼음 위에 2분 동안 둡니다.
올리고(dT) 비드를 재현탁한 후 필요한 양의 비드 현탁액을 새 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 자성 비드가 펠릿을 형성할 때까지 3분 동안 자석에 놓습니다. 상층액을 제거하고 동일한 양의 용해 완충액을 추가합니다. 비드를 다시 현탁시킵니다.
튜브를 자석에 다시 올려 놓고 3분 동안 상층액을 제거합니다. 첫 번째 정제를 위해 RNA 샘플 튜브에 용해 완충액을 추가하고 완전히 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 올리고(dT) 비드로 옮기고 피펫팅을 10회 이상 완전히 재현탁합니다.
샘플이 실온에서 연속적으로 회전하여 배양되도록 합니다. 15분 후 샘플을 자석 위에 5분 동안 또는 상층액이 투명해질 때까지 놓습니다. 상층액을 버리십시오.
600 마이크로리터의 세척 완충액을 비드에 넣고 조심스럽게 섞어 재현탁시킵니다. 다음으로, 300 마이크로리터의 세척 완충액 2를 비드에 넣고 조심스럽게 섞어 재현탁시킵니다. 튜브를 자석에 5분 동안 또는 상층액이 깨끗해질 때까지 놓습니다.
상층액을 버리십시오. 다음으로, 30 마이크로 리터의 차가운 10 밀리 몰 트리스 HCL을 샘플 튜브에 넣고 섭씨 70도에서 배양합니다. 5분 후 튜브를 자석에 빠르게 옮깁니다.
그리고 현탁액이 깨끗해지면 용출된 폴리(A)농축 RNA가 포함된 상층액을 새로운 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 두 번째 정제의 경우 용출된 RNA 샘플에 120마이크로리터의 용해 완충액을 추가하고 완전히 혼합합니다. 첫 번째 정제에 사용된 비드를 동일한 양의 용해 완충액으로 세척합니다.
피펫을 10회 돌려 비드를 다시 현탁시킨 다음 튜브를 자석에 5분 동안 올려놓은 후 상층액을 버립니다. RNA 용해 완충액 혼합물을 세척된 비드로 옮기고 피펫팅으로 완전히 혼합합니다. 앞에서 설명한 대로 비드를 세척한 후 25마이크로리터의 차가운 10밀리몰 트리스 HCL을 샘플 튜브에 넣고 섭씨 70도에서 배양합니다.
5분 후 튜브를 자석으로 빠르게 옮기고 현탁액이 깨끗해지면 용리된 폴리(a)농축 RNA가 포함된 상층액을 새로운 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음에, bisulfite 변환을 위해, 0.2 밀리리터 8 지구 관에 순화된 poly (A) enriched RNA 표본의 19 마이크로리터를 옮기고 10에 미리 결정된 것에 스파이크 통제의 1 마이크로리터를 의 000의 양 비율로 추가한다. 튜브에 전환 시약 130 마이크로리터를 첨가하고 완전히 혼합한 후 튜브를 PCR 기계에 넣고 PCR 프로그램을 시작합니다.
PCR 후 컬럼을 수집 튜브에 놓고 250마이크로리터의 RNA 결합 완충액을 컬럼에 추가합니다. 그런 다음 150마이크로리터의 중아황산염 처리 샘플을 컬럼과 피펫으로 철저히 옮깁니다. 컬럼에 95-100 % 에탄올 400 마이크로 리터를 넣고 캡을 빠르게 닫고 여러 번 뒤집습니다.
탈황 완충액으로 원심분리, 세척 및 중화를 반복한 후 컬럼을 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 20-30 마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 컬럼에 넣고 1분 동안 그대로 둡니다. 섭씨 25도에서 30초 동안 10, 000G에서 원심분리기를 하고 2.2마이크로리터의 상층액을 8개의 스트립 튜브로 옮겨 RNA 양과 품질을 평가합니다.
Poly(A)RNA 농축 효율은 모세관 전기영동 총 RNA 분석으로 평가되었으며, 그 결과 췌장암 세포주에서 이중 정제 후 리보솜 RNA 오염이 감소했습니다. 중아황산염 처리 전후의 RNA 양은 모세관 전기영동에 의해 평가되었습니다. 중아황산염 처리 후, RNA 크기 분포는 중아황산염 반응에 의해 야기된 단편화로 인해 200 내지 500개의 뉴클레오티드 피크를 보였다.
앰플리콘의 모세관 전기영동은 최소한의 프라이머가 남아 있고 과증폭 피크가 없는 성공적인 라이브러리 준비를 보여주었습니다. 시퀀싱 판독을 기준 서열에 정렬한 후, 총 판독 중 평균 2, 440개를 스파이킹 서열에 매핑하고, 분석된 총 C에서 T로의 전환율은 평균 99.81%에 도달했다
