시작하려면 칩 및 칩 캐리어를 멸균 조직 배양 접시에 있는 칩 크래들에 넣고 칩 활성화 시약을 준비하는 동안 조직 배양 후드에 따로 보관합니다. CR2 분말이 들어 있는 바이알에 CR1 용액 1밀리리터를 추가합니다. 바이알에서 알루미늄 호일로 감싼 15밀리리터 튜브로 용액을 옮깁니다.
4번의 헹굼과 4밀리리터의 CR2가 CR1 바이알을 통해 플러시될 때까지 이 과정을 반복합니다. 마지막 헹굼을 위해 바이알의 뚜껑을 닫고 뒤집어 잔류 분말을 제거합니다. 다음으로, CR1이 포함된 15밀리리터 튜브에 CR2 6밀리리터를 추가합니다.
마지막 10밀리리터 용액을 기포 없이 피펫과 혼합합니다. 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 용액이 하단 채널 출구에서 나오기 시작할 때까지 칩의 하단 채널 입구에 20마이크로리터의 CR1 용액을 추가합니다. 용액이 상단 채널 출구에서 나오기 시작할 때까지 상단 채널 입구를 통해 50마이크로리터의 CR1 용액을 추가합니다.
그런 다음 칩을 자외선 아래에 15분 동안 둡니다. 노출 후 상단 및 하단 채널에서 CR1 용액을 제거합니다. 100마이크로리터의 CR2 용액으로 두 채널을 세척합니다.
그런 다음 100마이크로리터의 DPBS로 두 번 씻으십시오. 칩의 상단 및 하단 채널에 대한 세포외 기질 용액을 준비합니다. 50 마이크로리터의 세포외 기질 용액을 출구에 방울이 나타날 때까지 하단 채널 입구에 추가합니다.
그런 다음 드롭이 입구에 나타날 때까지 상단 채널 입구에 50마이크로리터를 추가합니다. 칩 크래들 저장소에 DPBS를 추가합니다. 접시에 뚜껑을 덮고 섭씨 37도에서 밤새 칩을 배양하고 이산화탄소 인큐베이터 5%를 배양합니다.
다음 날, 100마이크로리터의 예열된 칩 팽창 매체로 칩의 상피 또는 상단 채널을 세척합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 미리 예열된 HIMEC 배지로 내피 또는 바닥 채널을 세척합니다. 계산 후 10 마이크로 리터의 HIMEC를 내피 채널에 첨가하십시오.
필요한 경우 오가노이드 성장 배지 또는 칩 확장 배지를 상피 채널에 추가하고 HIMEC의 파종 밀도를 확인합니다. 다음으로, 칩을 세포 배양 접시에 놓인 칩 크래들에 넣고 칩 크래들의 저장소에 DPBS를 추가한 다음 칩을 섭씨 37도에 2-3시간 동안 두어 HIMEC이 칩 멤브레인에 부착되도록 합니다. 배양 후 칩 크래들을 똑바로 세웁니다.
100마이크로리터의 따뜻한 HIMEC 배지로 내피 채널을 부드럽게 세척하고 오가노이드 성장 배지 또는 칩 확장 배지로 상피 채널을 세척하여 배지를 채널에 남겨둡니다. 엔테로이드 채취를 위해 배지를 부드럽게 흡입하고 세포 배양 매트릭스 하이드로겔이 들어 있는 웰을 500마이크로리터의 따뜻한 DPBS로 세척합니다. 각 웰에 250마이크로리터의 콜드 셀 회수 용액을 추가하고 새 피펫 팁으로 각 웰의 바닥을 긁어 세포 배양 매트릭스 하이드로겔을 방해합니다.
파쇄된 세포 현탁액을 얼음 위의 차가운 15밀리리터 튜브에 넣고 45분 동안 배양합니다. 배양 후 현탁액을 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 펠릿에 2ml의 따뜻한 장내 해리 배지를 추가하고 튜브를 섭씨 37도의 수조에 넣습니다.
60-120초 동안 10mL의 차가운 조직 세척제를 튜브에 넣습니다. 그런 다음, 펠릿을 200 마이크로리터의 칩 팽창 매체에 다시 현탁시키기 전에 상층액을 원심분리하고 제거합니다. P200 피펫을 사용하여 장내염액을 분리하고 현탁액을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다.
셀을 계산하고 칩 팽창 매체의 부피를 조정하여 밀리리터당 6개의 셀에 10의 6배 농도를 달성합니다. 그런 다음 30마이크로리터의 재현탁 셀 현탁액을 칩의 상단 채널에 추가합니다. 칩을 칩 크래들로 되돌린 후 저장소에 DPBS를 추가하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 밤새 칩을 배양합니다.
다음날 100 마이크로 리터의 칩 확장 매체로 상피 채널을 두 번 플러시하고 100 마이크로 리터의 HIMEC 배지로 내피 채널을 플러시합니다. 그런 다음 2밀리리터의 칩 팽창 매체를 상단 채널 입구 저장소에 추가하고 300마이크로리터를 상단 채널 출구 저장소에 추가합니다. 하단 채널 입구 저장소에 2밀리리터의 HIMEC 매체를 추가하고 하단 채널 출구 저장소에 300마이크로리터를 추가합니다.
포드를 프라이밍하고 포드에 칩을 추가합니다. 그런 다음 culture 모듈에 Pod를 추가합니다. 시간당 30마이크로리터의 유속을 설정하고 사이클을 시작합니다.
신생아 장을 칩에 사용하여 성장한 장 상피 세포는 융합 세포 단층을 형성한 후 성숙한 3차원 융모 유사 구조로 발달했습니다. 중증 괴사성 장염을 앓고 있는 신생아의 디스바이오틱 마이크로바이옴을 신생아 장 온 칩 모델에 추가한 결과, 대조군에 비해 TNF-알파 발현이 증가한 것으로 나타났습니다.
