0.2% PBST에 있는 항체로 표시된 초파리 유충 사체를 유리 슬라이드에 놓는 것으로 시작합니다. 실체 현미경으로 조정하여 유충 사체의 내부 표면이 위를 향하도록 합니다. 물티슈를 사용하여 과도한 PBST 용액을 흡수하십시오.
그런 다음 Anti-Fade 장착 매체를 섬세하게 추가합니다. 그런 다음 해부된 유충을 덮는 슬라이드에 덮개 슬립을 놓고 기포가 형성되지 않도록 천천히 부드럽게 덮습니다. 가장자리 주위에 손톱 광택제를 발라 커버 슬립을 제자리에 고정합니다.
형광 감쇠를 최소화하기 위해 슬라이드를 어두운 곳에 보관하십시오. 이미지 획득을 위해 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경과 63x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하십시오. 그런 다음 실험의 요구 사항에 가장 잘 맞도록 파장과 레이저 출력을 조정합니다.
신경근 접합부를 식별하고 세그먼트 A 3에서 4번 근육의 이미지를 캡처하려면 488나노미터 레이저를 선택하여 알파 튜불린 또는 Futsch를 활성화하고 546나노미터 레이저를 선택하여 HRP 이미징 트랙을 활성화합니다. 프레임 크기 1, 024 x 1, 024 픽셀, 디지털 줌 1.0, 이미징 간격 0.8마이크로미터를 달성하도록 매개변수를 수정합니다. 근육의 미세소관을 시각화하려면 기관 가지가 더 적기 때문에 A 3에서 A 5까지의 세그먼트에서 근육 2의 이미지를 캡처합니다.
알파 튜불린을 활성화하기 위한 488 나노미터 레이저와 T3605 이미징 트랙을 활성화하기 위해 633 나노미터 레이저를 선택하십시오. 이미징 매개 변수를 프레임 크기 1, 024 x 1, 024 픽셀, 디지털 줌 2.0 및 이미징 간격 0.4마이크로미터로 조정합니다. 신경근 접합부의 시냅스 전후 미세소관 조직 모두 항-알파 튜불린(anti-alpha tubulin)으로 표지되었습니다.
Futsch 염색은 시냅스 전 뉴런에 안정적인 미세소관이 풍부함을 반영했습니다. 단백질 카타닌 60을 절단하는 미세소관이 시냅스전 뉴런에서 과발현될 때 항-풋치의 신호 강도 감소가 관찰되었습니다. 축삭돌기 줄기의 염색 강도는 가지의 염색 강도보다 강했습니다.
Katanin 60 돌연변이는 미세소관 루프를 증가시켰습니다. Katanin 60의 과발현은 단자 버튼 내에서 짧은 미세소관 단편을 유발했습니다. 알파 튜불린 염색은 핵 주위의 명확한 미세소관 네트워크를 보여주었습니다.
근육 세포는 핵 주위 미세관 강도가 현저하게 증가했으며 Katanin 60 돌연변이에서 더 강한 다발을 나타냈습니다. 과발현은 미세소관 섬유의 단편화를 초래했습니다.
