먼저, 미토콘드리아 표적 HyPer7을 발현하는 중간 로그 단계 발아 효모 세포 배양 1밀리리터를 취합니다. 30 초 동안 6, 000 G에 세포를 분리하고, 관에 있는 10 20 마이크로리터를 남겨두는 상층액을 제거하. 마이크로 피펫을 사용하여 잔류 배지와 부드럽게 혼합하여 세포 펠릿을 다시 부유시킵니다.
그런 다음 송풍기 또는 보푸라기가 없는 티슈를 사용하여 유리 현미경 슬라이드를 청소하고 슬라이드에 1.8마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다. 마지막으로 기포가 생기지 않도록 비스듬히 천천히 내려 1.5번 유리 커버 슬립으로 셀을 덮습니다. 그런 다음 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓습니다.
세포를 이미지화하려면 각 형광 채널에서 검출 가능한 신호와 허용 가능한 분해능을 보장하도록 획득 조건을 설정합니다. 예를 들어, sCMOS 카메라가 장착된 스피닝 디스크 컨포칼 현미경에서는 2x2 비닝, 20-40% 레이저 출력, 200-600밀리초 노출을 사용합니다. 다음으로 영상 히스토그램을 검사합니다.
12비트 이미지에서 픽셀 값의 총 동적 범위가 채도 없이 최소 수백 개의 회색 수준인지 확인합니다. 또한 범위가 소음 수준보다 한 자릿수 더 높은지 확인하십시오. 노이즈 수준을 계산하려면 이미지의 셀이 없는 영역에서 픽셀 값의 표준 편차를 측정합니다.
그런 다음 획득 간 지연 없이 타임랩스 이미지를 수집하여 이미징 조건이 미토콘드리아의 신호 안정성과 산화 스트레스에 미치는 영향을 평가합니다. 현미경 획득 소프트웨어 또는 ImageJ를 사용하여 각 형광 채널의 평균 픽셀 값을 측정하여 신호 안정성을 보장합니다. 실험에 타임 랩스 이미징이 포함되지 않은 경우 형광이 2개 또는 3개의 반복되는 Z 스택에서 안정적인지 확인합니다.
신생 효모에 대해 총 6마이크로미터의 스택 깊이에서 0.5마이크로미터의 Z 간격으로 이미지를 획득합니다. Z 스택을 수집하는 경우 Z 간격이 데이터 세트의 모든 이미지에 대해 동일하고 전체 셀을 포함하는지 확인합니다. 또한 투과광 이미지를 획득하여 세포 경계를 문서화할 수 있습니다.
