시작하려면 피지에서 다중 채널 Z 스택 이미지를 열고 원하는 바이오센서 분석 스크립트 파일을 엽니다. 스크립트 편집기 창에서 실행을 클릭하여 스크립트를 실행합니다. 그런 다음 표시되는 대화상자 창에 요청된 정보를 입력합니다.
비율 계산을 위해 분자와 분모의 채널 번호를 선택합니다. 미토콘드리아를 표적으로 하는 HyPer7의 경우, 분자는 488나노미터에서 여기된 채널이고 분모는 405나노미터에서 여기된 채널입니다. 투과광 이미지의 채널 번호(있는 경우)를 선택하고, 없는 경우 0을 선택합니다.
그런 다음 원하는 배경 빼기 방법을 선택합니다. 배경이 균일한 경우 이미지 영역 선택을 클릭하여 이미지의 배경 레벨을 측정합니다. 그런 다음 원하는 노이즈 제거 방법을 선택하여 검출기 판독값의 무작위 변동을 줄입니다.
이미지 영역 선택을 클릭합니다. 고정값 옵션을 선택하여 이전에 측정한 노이즈 수준을 입력하며, 이는 일반적으로 이미징 조건이 일정하게 유지되는 경우 잘 작동합니다. 미토콘드리아를 정확하고 일관되게 검출하려면 Otsu 또는 Maximum Entropy와 같은 임계값 알고리즘을 선택하십시오.
실험의 모든 이미지에 동일한 알고리즘을 사용하되 미토콘드리아가 정확하게 인식되는지 확인합니다. 그런 다음 셀당 관심 영역 수를 선택합니다. 예를 들어, 어미 새싹 차이를 측정하는 경우 두 개를 선택합니다.
측정값 및 비율 이미지를 저장할 출력 폴더를 선택합니다. 배경 또는 노이즈 보정의 경우 이미지 영역 선택을 선택합니다. 프롬프트에 따라 사각형 ROI 툴을 사용하여 배경 영역을 그리고 확인을 클릭합니다.
개별 세포 또는 세포 내 영역을 분석할 때 명시야 이미지를 기반으로 관심 영역을 그립니다. ROI 내에서 임계값이 있는 미토콘드리아만 측정되므로 ROI가 세포 윤곽과 정확하게 일치할 필요는 없습니다. 각 ROI를 생성한 후 T를 눌러 선택한 ROI를 ROI 매니저에 추가합니다.
ROI 관리자에서 모두 표시를 선택하여 표시된 셀을 문서화합니다. 추가된 각 영역은 ROI 관리자 목록에 번호가 매겨진 항목으로 표시됩니다. 셀당 두 개 이상의 ROI를 분석하는 경우 분석된 각 셀에 대해 동일한 순서로 ROI를 표시합니다.
원하는 ROI를 모두 ROI 관리자에 추가한 후 셀 표시 대화상자 창에서 확인을 클릭합니다. 그런 다음 측정 테이블 형식을 선택합니다. Multi Measure(다중 측정) 대화 창에서 measure-all-slices(모든 슬라이스 측정) 및 one-row-per-slice(슬라이스당 한 행) 옵션을 선택하여 원하는 형식의 표를 생성합니다.
공정 다중 ROI 테이블을 사용합니다. rscript를 사용하여 조각당 한 행 옵션으로 만든 테이블을 처리할 수 있습니다. append-results 옵션을 선택하지 마십시오.
스크립트를 사용하여 선택한 폴더에 출력 파일을 저장합니다. 이제 피지에서 비율 Z 스택 이미지를 열어 색상이 지정된 비율 이미지를 생성합니다. 그런 다음 colorize_ratio_image 엽니다.
ijm 스크립트 파일을 클릭하고 스크립트 편집기 창에서 실행을 클릭합니다. 요청된 정보를 입력하라는 대화 상자 창이 나타납니다. 변조되지 않은 옵션에서는 모든 미토콘드리아 픽셀이 동일한 밝기로 나타납니다.
일부 이미지는 희미하고 밝은 픽셀이 비율 이미지에 기여하기 때문에 노이즈가 나타날 수 있습니다. intensity modulated 옵션을 사용하여 노이즈를 줄입니다. 표시된 최소값 및 최대값 방법에서 실험에서 관찰된 평균 최소값 및 최대값에 가까운 값을 선택합니다.
일관성을 유지하려면 동일한 이미징 조건을 사용하여 모든 이미지를 획득하고 동일한 최소값 및 최대값을 사용하여 모든 이미지를 표시합니다. 그런 다음 투영 모드를 선택하여 Z 스택을 투영하고 채색 전에 전체 미토콘드리아 집단을 표시합니다. 최대 강도 투영의 경우 최대를 선택합니다.
평균 강도 투영을 만들려면 평균을 선택합니다. 마지막으로 색상이 지정된 이미지를 저장할 폴더를 선택합니다. 변조되지 않음 옵션을 선택한 경우 나타나는 대화 상자 창에서 색상 구성표를 선택합니다.
피지에 내장된 불 또는 무지개 RGB 조회 테이블 또는 ImageJ의 LUT 형식으로 원하는 조회 테이블을 활용합니다. 스크립트를 사용하여 선택한 폴더에 출력 파일을 저장합니다. HyPer7 태그가 붙은 미토콘드리아의 산화 환원 비율은 과산화수소 농도에 대한 용량 의존적 반응을 보였으며, 이는 외부에서 첨가된 과산화수소가 1-2밀리몰에서 정체기에 도달했습니다.
미토콘드리아 과산화수소의 차이는 효모 세포 내에서 관찰되었습니다. 과산화수소 바이오센서 판독값의 통계적으로 유의한 감소는 모세포에 비해 새싹의 미토콘드리아에서 감지되었습니다.
