Generating Kidney Organoids from Induced Pluripotent Stem Cell Suspension Culture

7번째 배양일에 iPSC 세포 현탁액에서 II기 배지를 제거하는 것으로 시작합니다. 이제 2 밀리리터의 DPBS로 세포를 씻으십시오. 각 웰에 1밀리리터의 세포 분리 용액을 피펫팅합니다.

그런 다음 플레이트를 37도의 인큐베이터에 5분 동안 놓습니다. 배양 후 2단계 배지 1m리터를 세포에 넣고 세포가 표면에서 분리될 때까지 완전히 혼합합니다. 세포 현탁액을 15밀리리터 튜브에 모은 다음 실온에서 400g에서 3분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후 상층액을 버리고 세포 펠릿을 2mL의 3단계 배지에 재현탁시킵니다. 용액을 부드럽게 섞는다. 이제 서스펜션을 1:3 비율로 6웰의 저접착 플레이트에 파종합니다.

이산화탄소 5%가 포함된 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터의 궤도 셰이커에 플레이트를 놓습니다. 현탁액 배양물에서 배지를 제거하려면 먼저 무균 가위를 사용하여 1밀리리터 피펫의 끝을 잘라냅니다. 그런 다음 6웰 플레이트를 부드럽게 저어 오가노이드를 중앙 집중화합니다.

다음으로, 준비된 피펫으로 오가노이드를 흡인하고 15밀리리터 튜브에 넣고 5분 동안 그대로 둡니다. 상층액을 흡인하여 오가노이드가 튜브의 바닥에 남아 있는지 확인합니다. 그런 다음 피펫 스테이지 III 배지를 플레이트에 넣습니다.

혼합물을 피펫팅하여 오가노이드를 재현탁합니다. 오가노이드를 6웰의 저접착 플레이트로 다시 도금합니다. 인큐베이터에서 분당 60회전으로 저접착 플레이트를 계속 흔듭니다.

12일째 되는 날, 배지를 IV기 배지로 교체합니다. 신장 오가노이드는 관형 구조를 나타내며 응집 후 18일 후에 명시야 이미지에서 쉽게 관찰할 수 있습니다. CD31 내피 세포를 유도하였다.

덱스트란은 신장 오가노이드의 근위 세뇨관으로 옮겨졌습니다.