시작하려면 AAV 관련 벡터가 있는 마우스를 마우스 뇌에 주입합니다. 3-4주 동안 바이러스를 주입한 후, 마취된 쥐의 복부와 목의 뒤쪽 부위를 면도합니다. 70% 에탄올 용액으로 3개의 요오드 스크럽을 번갈아 가며 사용하여 면도한 부위를 청소합니다.
견갑골 사이의 피부를 복부 절개합니다. 그런 다음 절개 부위에 수술용 거즈를 놓고 동물이 머리를 외과 의사를 향하도록 앙와위 상태로 놓습니다. 그런 다음 쇄골 위의 목 오른쪽을 수직으로 작게 절개하여 오른쪽 경동맥과 경정맥을 노출시킵니다.
피하 조직을 분리한 후 우측 외부 경정맥을 노출시키고 정맥 아래에 봉합사를 놓습니다. 경정맥의 말단부를 묶어 혈류를 멈춥니다. 마이크로 집게와 가위를 사용하여 무너진 정맥을 작게 절개합니다.
이제 베벨이 아래를 향하도록 정맥 카테터를 삽입하고 오른쪽 심방에 도달할 때까지 상정맥 쪽으로 근위부로 움직입니다. 7-0 실크 봉합사를 사용하여 카테터를 혈관에 고정합니다. 결합 조직을 절개하여 오른쪽 총경동맥을 노출시킵니다.
근위에, 내부 및 외부 경동맥이 나뉘는 수준에서 고정되지 않은 상태로 유지되는 두 개의 7-0 실크 봉합사 봉합사 루프를 미리 배치합니다. 혈류를 일시적으로 멈추려면 미리 삽입된 봉합사 고리를 당깁니다. 그런 다음 마이크로 가위 또는 27 게이지 바늘을 사용하여 혈관 벽에 작은 구멍을 만듭니다.
봉합사 루프를 풀면서 동맥 카테터를 근방으로 삽입하고 대동맥 판막을 건드리지 않고 카테터를 대동맥궁에 도달하도록 전진시킵니다. 미리 배치된 두 개의 봉합사를 사용하여 카테터를 혈관에 고정합니다. 모든 카테터를 피하로 터널링하고 미리 절개한 절개를 통해 목 뒤쪽의 바깥쪽에 삽입하고 복부 절개를 닫습니다.
카테터를 25게이지 바늘 튜브로 만든 실리콘 코팅 튜브 커넥터의 정맥 또는 동맥 포트에 연결합니다. 복부 절개 부위를 봉합한 후 등피부를 봉합사로 밀봉할 때 커넥터를 피하로 고정합니다. 스테인리스 스틸 수술용 와이어를 사용하여 카테터에 헤파린화 식염수를 채우고 카테터 끝을 단단히 막습니다.
수술 후 24시간 동안 자동 채혈 시스템에 동물을 부착하려면 목 뒤쪽의 금속 링에 밧줄 고리를 연결하고 동맥선을 연결합니다. 동맥 카테터가 주입 라인에 연결되면 정맥 카테터를 샘플링 라인에 부착합니다. 주입 시간과 투여량을 분당 500마이크로리터에서 킬로그램당 0.5밀리그램으로 설정합니다.
식염수로 희석하는 검체를 포함하여 혈액 채취 시간과 빈도를 설정합니다. 시스템은 샘플링된 혈액을 대체하기 위해 동일한 양의 식염수를 자동으로 보충합니다. 자동 사전 주입을 수행합니다.
다음으로, 분당 500 마이크로 리터의 주입 속도로 약물 클로자핀 N- 옥사이드의 자동 정맥 주사를 수행합니다. 그런 다음 주사 후 혈액 샘플링을 수행합니다. 아치형 핵에 AAV-hM3Dq-mCherry의 일방적인 입체 주사를 받은 성인 Kiss1-EYFP 여성의 황체 형성 호르몬 패턴이 제시됩니다.
발정 황체 형성 호르몬 수치는 일반적으로 낮지만, 박동성 방출로 인해 변화가 관찰됩니다. 황체 형성 호르몬 수치의 급격한 상승은 클로자핀 N-옥사이드 주사에 대한 반응으로 발생합니다. Kiss1-EYFP와 함께 국소화된 대부분의 mCherry 뉴런은 바이러스 및 뉴런 활성화가 표적 집단에 특이적임을 입증했습니다.
Kisspeptin-10의 IP 주입에 대한 반응에 이어 diestrus 야생형 마우스에서 황체 형성 호르몬 박동성 방출 패턴을 보여줍니다. 발정기의 여성에게 전형적으로 나타나는 맑은 황체 형성 호르몬 맥박이 관찰되어 낮은 기초 황체 형성 호르몬 수치를 보였습니다. 황체 형성 호르몬의 즉각적이고 강력한 증가는 키스펩틴 투여에 대한 반응으로 감지되었습니다.
