먼저, 성장 인자로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트의 IPSC 유지 배지에서 hiPSC를 배양하면 세포외 기질 겔이 감소했습니다. 세포가 80 내지 90%v에 도달하면, 플레이트에서 배지를 제거하고 DPBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 700-800 마이크로 리터의 0.48 밀리몰 EDTA를 첨가하고 실온에서 1 분 동안 배양합니다.
소화액을 제거하고 접시를 섭씨 37도에서 3-5분 동안 배양합니다. 세포가 시트로 분해되면 2mL의 IPSC 유지 배지를 추가하여 분해를 종료합니다. 셀 현탁액을 6웰 낮은 부착 플레이트로 옮깁니다.
섭씨 37도에서 이산화탄소 5%와 RPM 60RPM으로 세포를 배양하여 구형 배아체 또는 EB를 형성합니다. 24시간 후, 과거 피펫을 사용하여 EB를 원심분리기 튜브로 옮기고 상층액을 제거하기 전에 5-10분 동안 침전되도록 합니다. MSC 분화 배지를 튜브에 추가하고 EB를 2mL의 MSC 분화 배지가 있는 6웰 로우 부착 블레이드로 옮깁니다.
섭씨 37도에서 이산화탄소 5%로 셰이커에서 7일 동안 EB를 배양합니다. 8일째 되는 날, 앞에서 설명한 대로 EB를 원심분리기 튜브로 옮깁니다. EB가 침전되면 튜브에서 상층액을 제거합니다.
MSC 유지 배지를 튜브에 추가하고 EB를 2mL의 MSC 유지 배지가 있는 성장 인자 감소 세포외 기질 겔 코팅된 6웰 플레이트로 옮깁니다. 세포 접착 후 배양액이 90% 밀도에 도달할 때까지 배지를 변경합니다. 다음으로, EB 유래 배양액을 섭씨 37도의 해리 용액으로 처리합니다.
세포의 일부가 단일 세포로 분해되면 2mL의 MSC 유지 배지를 추가하여 분해를 종료하고 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮깁니다. 웰에서 남은 소화되지 않은 세포를 DPBS로 한 번 씻습니다. 그리고 앞에서 설명한대로 다시 소화하십시오.
그런 다음 셀 현탁액을 250g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 젤라틴으로 코팅된 배양 플레이트에 세포를 파종합니다. MSC 유지 배지에서 세포를 정기적인 배지 변화와 함께 90% 밀도로 배양합니다.
문화권은 앞에서 설명한 대로 hiIPC 라인입니다. 세포가 50-60%의 밀도를 달성하면 플레이트에서 IPSC 유지 매체를 제거합니다. 2밀리리터의 MSC 유지 배지를 추가합니다.
그리고 섭씨 37도에서 14일 동안 배양하고 매일 중간 변화로 5%의 이산화탄소를 배양합니다. MSC의 성숙을 위해 섭씨 37도에서 해리 용액으로 단층 배양을 처리하십시오. 세포의 일부가 단일 세포로 분해되면 2mL의 MSC 유지 배지를 웰에 추가하여 분해를 종료하고 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮깁니다.
소화되지 않은 나머지 세포를 DPBS로 한 번 씻고 앞서 설명한 대로 소화합니다. 그런 다음 이전에 시연된 대로 세포 현탁액을 원심분리하고 젤라틴 코팅 배양 접시에 세포를 시드합니다. MSC 유지 배지에서 세포를 정기적인 배지 변화와 함께 90% 밀도로 배양합니다.
EB 형성 방법에서 hiIPC 콜로니는 분화 전에 조밀한 형태를 나타냈습니다. 해리 후 균일한 구형 EB가 형성되어 시간이 지남에 따라 부피가 커졌습니다. 그 후, EB는 부착성 단층 세포로 형질전환되어 18일째까지 90%의 밀도를 달성하고 두 번의 통과 후 방추체 모양 형태를 획득했습니다.
유사하게, 단층 방법에서 세포는 증식하여 다층 부착 세포를 형성했습니다. 여러 번 패키징한 후 세포는 전형적인 스핀들 모양과 소용돌이 콜로니를 가진 MSC로 성숙했습니다. 유세포 분석 결과 hiIPC는 CD90에 대해 양성이고 CD34, CD45, CD105 및 CD73에 대해 음성인 것으로 나타났습니다.
분화 후 MSC를 구동하는 hiIPC는 CD90, CD73 및 CD105를 발현한 반면 CD34 및 CD45에 대해서는 음성을 유지했습니다. 단층 유래 MSC는 EB 방법보다 더 높은 칼슘 침전물 형성을 보였습니다. 그러나 지방 분화 능력과 연골 분화 능력에서는 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다.
두 방법의 증식 능력은 최대 20 구절까지 유지되었습니다.
