호중구 세포외 트랩(NET) 채취를 위한 쥐 호중구 분리의 1단계 및 2단계 방법

골수 채취를 시작하려면 안락사된 쥐를 75% 에탄올에 담가 털과 피부를 소독합니다. 쥐를 눕히고 엉덩이에서 하지를 절단하여 대퇴골 머리를 보호합니다. 해부 가위를 사용하여 호크 관절의 인대를 절단하십시오.

그런 다음 무릎 관절을 뒤로 접어 대퇴골과 경골을 노출시킵니다. 겸자와 가위를 사용하여 뼈에 연결된 근육, 힘줄 및 기타 조직을 조심스럽게 제거합니다. 5mm 바늘 주사기로 양쪽 뼈 끝을 통해 골수를 찔러 골수 매트릭스를 풉니다.

이제 새 주사기를 사용하여 10-15ml의 RPMI 배지로 골수를 씻어냅니다. 골수 세포를 섭씨 300도에서 10분 동안 20G로 원심분리합니다. 상층액을 버리고 5-10 밀리리터의 적혈구 용해 완충액에 세포를 재현탁시킵니다.

현탁액을 배양한 후 혼합물에 HBSS 부피의 4배를 추가합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 600G에서 세포를 원심분리합니다. 생성된 펠릿을 추가 사용을 위해 사용하십시오.

먼저 쥐 골수 호중구 분리 키트로 호중구를 분리합니다. 밀도 구배를 만들기 위해 15 밀리리터 원심 분리 튜브에 col 시약 당 80-55 %의 2 밀리리터를 층층화합니다. 그런 다음 분리된 호중구 또는 쥐 골수 호중구 분리 키트로 분리된 세포의 재현탁액을 튜브에 피펫팅합니다.

튜브를 섭씨 800도에서 40분 동안 20G로 원심분리합니다. 멸균 피펫을 사용하여 65-70% 경계에 있는 세포층을 포함하여 70% 그래디언트 층을 수집합니다. 셀 현탁액을 새 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

튜브에 HBSS 15mL를 넣고 부드럽게 뒤집어 내용물을 섞습니다. 마지막으로 튜브를 실온에서 300G에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 원스텝 공정의 경우, 골수 현탁액을 밀도 구배 튜브에 직접 피펫팅한 후 앞서 설명한 대로 원심분리합니다.

다음으로, 75-70% 그래디언트 경계에 있는 레이어를 포함하여 70% 그래디언트 레이어를 피펫팅합니다. 이 셀 현탁액을 10ml의 HBSS가 들어 있는 새로운 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 실온에서 400G에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.

혈구계를 사용하여 분리된 호중구를 계수하고 트리판 블루 염색을 통해 세포 생존율을 평가합니다. 2단계 방법은 1단계 방법에 의해 달성된 50%에 비해 90%as의 향상된 순도 수준을 가졌습니다.