쥐 호중구 세포외 트랩(NET)의 획득 및 검증

먼저, 분리된 쥐 호중구를 4밀리리터의 보충된 RPMI 배지에 재현탁시켜 멸균된 10cm 페트리 접시에 담습니다. 다음으로, 호중구 현탁액에 4마이크로리터의 PMA를 첨가하여 NET의 형성을 유발합니다. 혼합물을 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 아래에서 3시간 동안 배양합니다.

음성 대조군의 경우, 분비된 NET을 분해하기 위해 호중구 현탁액에 4-5 마이크로리터의 DNASE1을 첨가합니다. 그런 다음 4ml의 HBSS를 추가하여 그물을 씻습니다. 각 플레이트에 대해 4mL의 신선한 배양 배지로 플레이트를 세척하여 그물을 분리합니다.

이제 세척 매체를 새 튜브와 피펫에 자주 수집하여 그물이 완전히 다시 부유되도록 합니다. 300g에서 현탁액을 섭씨 20도에서 10분 동안 원심분리하여 부유 세포를 제거합니다. 그런 다음 새 튜브에 NET이 있는 상층액 배지를 수집합니다.

1.4cm 유리 커버 슬립을 배치한 24웰 플레이트에 NET과 부유 전지의 현탁액을 원심분리하여 부유 전지를 침전시킵니다. 그런 다음 4% PFA로 커버 슬립의 셀을 고정하고 NET의 존재 여부를 확인합니다. 그런 다음 파라핀 필름으로 덮인 시험관 스탠드에 HBSS 한 방울을 놓습니다.

커버 슬립을 HBSS 물방울에 뒤집어 세척합니다. 세척 후 세포를 250마이크로리터의 0.5x Triton X-100에 넣고 실온에서 10분 동안 배양하여 투과시킵니다. 그런 다음 HBSS에서 1분 동안 세포를 세 번 세척합니다.

실온에서 10% 정상 당나귀 혈청에 세포를 밀봉합니다. 마지막으로, 섭씨 4도에서 밤새 70-90 마이크로리터의 항쥐 항체로 세포를 배양합니다. 커버 슬립을 HBSS에서 각각 5분씩 3회 세탁합니다.

이제 HBSS를 세척하기 전에 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 2차 항체의 커버 슬립을 배양합니다. 세포핵과 NETs 골격을 70-90 마이크로리터의 DAPI로 염색합니다. HBSS 세척을 각각 5분씩 3회 실시합니다.