쥐 호중구 세포외 트랩(NET)의 형광 정량 분석 및 세포 분석

시작하려면 분리된 쥐 NET 샘플 50마이크로리터를 450마이크로리터의 Tris-EDTA 완충액이 있는 튜브에 피펫팅합니다. 이제 100 마이크로리터의 DNA 표준물질과 샘플을 피펫팅하여 96웰 플레이트에 넣습니다. 동일한 양의 분석 시약을 웰에 추가합니다.

그런 다음 직사광선에 노출되지 않도록 실온에서 2-5분 동안 접시를 배양합니다. 플레이트를 형광 마이크로플레이트 리더에 놓습니다. 약 530나노미터의 방출 스펙트럼과 약 480나노미터의 흡수 스펙트럼을 설정합니다.

1마이크로리터의 핵 염색체에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 다음으로, cell-free DNA 균주 1마이크로리터에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 형광 염료를 부드럽게 섞습니다.

샘플 플레이트를 유세포분석기에 로드합니다. SYTOX Green 채널로 전환한 다음 HEXT 채널을 선택합니다. 조명을 파란색 377/447로 설정하고 노출 시간을 300, 000마이크로초로 조정합니다.

Focused Setup(집중 설정)을 클릭한 다음 Register Auto(자동 등록)를 클릭하여 초점을 자동으로 조정합니다. SYTOX 녹색 채널을 선택하고 조명을 녹색 483/536으로 설정합니다. SYTOX Green의 노출 시간을 30, 000마이크로초로 설정합니다.

클릭 스캔 시작 스캔 프로세스를 시작합니다. NET 분비에 대한 유사한 반응은 PMA 자극에 관계없이 말초 호중구와 골수 호중구 간에 식별 가능했습니다. 쥐 그물은 또한 서로 제한된 가교 능력을 나타냈다.

PMA를 사용한 배양은 4시간 후 cell-free DNA 함량이 10% 증가하여 NET 형성을 유발하는 경향이 더 높다는 것을 나타냅니다.