인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포 해리 및 최적 동결 보존 단계 결정

모든 번역이 AI에 의해 생성되었음을 참고하십시오. 영어 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

56 Views

•

03:06 min

•

November 3rd, 2023

DOI :

10.3791/200823-v

November 3rd, 2023

•

Xinyue Bai*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Ting Zhang*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xinyue Zhu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xianyu Huang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Haiyun Liu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaoyan Ding⁸, Mei Jiang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaodong Sun¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷

¹Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, ²National Clinical Research Center for Eye Diseases, ³Shanghai Clinical Research Center for Eye Diseases, ⁴Shanghai Key Clinical Specialty, ⁵Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases, ⁶Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine, ⁷Shanghai Engineering Center for Precise Diagnosis and Treatment of Eye Diseases, ⁸Stem Cell Core Facility, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinese Academy of Sciences

* 이 저자들은 동등하게 기여했습니다

필기록

시작하려면 해동된 차가운 기저막 매트릭스 바이알을 DM EM F12 12ml로 희석합니다. 현탁액을 잘 섞는다. 24웰 플레이트의 각 웰에 하나의 커버 슬립을 추가합니다.

그런 다음 250 마이크로 리터의 희석 매트릭스 용액을 각 웰에 피펫팅합니다. 배양된 hESC 유래 망막 색소 상피 세포판의 배양 배지를 폐기합니다. 웰당 예열된 PBS 1밀리리터로 플레이트를 두 번 세척합니다.

다음으로, 0.5ml의 세포 해리 시약을 배양 플레이트의 웰에 추가하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하여 분해를 시작합니다. 배양 후 현미경으로 세포를 관찰하여 분해가 끝났는지 확인합니다. 이제 1밀리리터 피펫을 사용하여 셀 현탁액을 위아래로 10회 부드럽게 피펫팅합니다.

현탁액을 희석하기 위해 예열된 배양 배지를 추가합니다. 그런 다음 실온에서 3분 동안 250G로 원심분리합니다. 원심분리기 튜브에서 상층액을 붓습니다.

그런 다음 세포 펠릿을 배양 배지 2mL에 다시 현탁시킵니다. 피펫을 사용하여 세포를 10-15회 혼합합니다. 40마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 셀 현탁액을 여과합니다.

다음으로, 망막 색소 상피 세포를 계산합니다. 도금하기 전에 코팅 용액을 흡입하십시오. 그런 다음 각 웰에 1mL의 배양 배지를 추가하고 커버 슬립에 세포를 파종합니다.

EDU 통합 및 염색 후 형광 현미경으로 5개의 무작위 필드의 이미지를 캡처합니다. EDU 양성 세포의 백분율을 계산합니다. 그런 다음, 해당하는 비율 시간 곡선을 플로팅하여 성장 곡선을 생성합니다.

마지막으로, 각 세포주에 대한 지수 단계에서 동결 창을 결정합니다. 망막 색소 상피 세포는 처음에는 특징적인 육각형 형태를 잃었지만 나중에 기하급수적인 성장 단계에서 다시 회복했습니다. 세포를 추가로 일주일 동안 배양했을 때, 세포 증식이 감소하였다.

EDU 증식 분석은 P2 day five 세포가 더 높은 증식 속도를 보인 반면 P2 day 11 세포는 감속 단계에 진입했음을 확인했습니다.

더 많은 비디오 탐색

Human Embryonic Stem Cells

Retinal Pigment Epithelial Cells

Cell Dissociation

Cryopreservation

DMEM F12