췌관 선암종 세포를 위한 렌티바이러스 준비 및 재프로그래밍 형질도입

1 2 시작하려면,GMEN이 함유된 15cm 접시에서 transfection 4 24시간 전에 HEK 293T 세포 3을 확인합니다. 5 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.6 및 5% 이산화탄소7 40-50% 밀도에 도달할 때까지. 8 15밀리리터 플라스틱 튜브 3개에 적절한 렌티바이러스 이름을 붙입니다.

10 각 튜브에 1.710 밀리리터의 환원 혈청 배지 11 및 90 마이크로리터의 형질주입 시약을 추가합니다. 12 실온에서 튜브를 배양하기 전에 13을 소용돌이치게 하여 내용물을 혼합합니다. 14 5분 후, 패키징 벡터 혼합물 15를 transfection 매체 및 와류에 첨가합니다.

그런 다음 7.5마이크로그램의 재프로그래밍 벡터(17) 및 pWPT-GFP 대조군(18)을 각각의 형질주입 혼합물에 첨가한다. 19 실온에서 15분 동안 배양하기 전에 20 2초 동안 튜브를 소용돌이칩니다. 21 각 렌티바이러스로 293T 세포를 transfection하려면 22 방울 방식으로 transfection DNA 혼합물을 접시에 추가합니다.

23 형질주입된 세포를 섭씨 37도, 24도, 이산화탄소 5%에서 배양합니다. 25 14 내지 16시간 후에, 26 배지를 30 밀리리터(27)의 신선한 293T 배지(28)로 교체하고, 60 내지 72시간 동안 배양을 계속한다. 29 매일 세포를 관찰하고 30 transfection 효율을 확인합니다.

31 다음으로, 바이러스 형질주입 배양액(32)을 15밀리리터 튜브(33)에 옮기고, 섭씨 4도에서 1, 932G에서 10분(34) 스핀다운한다. 도 35: 0.45 미크론 주사기 필터(37)를 사용하여 렌티바이러스 상층액(36)을 새로운 50밀리리터 튜브에 여과한다. 38 렌티바이러스 형질도입 하루 전, 39는 웰당 100, 000개의 PDAC 세포를 포함하는 6-웰 플레이트(40)의 두 웰을 준비한다.

41 2 밀리리터의 예열된 PDAC 매체와 함께 2개의 15 밀리리터 튜브(42)를 준비한다. 43 첫 번째 튜브에 44는 12밀리리터의 재프로그래밍 렌티바이러스를 첨가합니다. 45 그런 다음 12마이크로리터의 폴리브렌 46을 넣고 피펫팅으로 혼합합니다.

47 두 번째 튜브에, 48 2 마이크로 리터의 폴리 브렌을 첨가하십시오. 49 이제 6-웰 플레이트(51)의 각 웰(50)로부터 매체를 조심스럽게 제거하고 실온에서 PBS로 한 번 세척한다. 52 튜브 1에서 재프로그래밍 감염 매체(53)를 첫 번째 웰에 추가합니다.

54 : 튜브 2의 혼합물을 두 번째 웰에 추가합니다. 55 섭씨 37도에서 56%의 이산화탄소와 5%의 산소로 밤새 세포를 배양합니다. 57 다음날, 두 웰 모두로부터의 배지(58)를 새로운 PDAC 배지(59)로 교체하고, 시연된 바와 같이 최대 48시간 동안 배양(60)을 계속한다.