유도만능줄기세포를 위한 iMEF 공급세포의 제조 및 재프로그래밍 형질도입

1 시작하려면 6-웰 플레이트2에 웰당 2ml의 0.2% 젤라틴 용액을 코팅합니다. 3 접시를 섭씨 37도 4와 5 % 이산화탄소에서 30 분 동안 배양합니다. 5 다음으로, 10 밀리리터7의 예열된 인간 섬유아세포 배지를 함유한 15밀리리터 튜브(6)에 iMEF를 적하 방식으로 첨가하고, 8을 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합한다.

9 셀 현탁액을 309G에서 3분 동안 원심분리합니다. 10 그리고 펠릿 11을 인간 섬유아세포 배지 12밀리리터에 다시 현탁시키기 전에 상층액을 제거한다. 12 : 셀 현탁액 (13) 2 밀리리터를 젤라틴 코팅 된 6 웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다.

14 그리고 섭씨 37도에서 밤새 배양하고 15 % 이산화탄소. 16 렌티바이러스에 감염된 17 및 감염되지 않은 PDAC에서 배지를 버리고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 18 그런 다음 500 마이크로 리터의 트립신을 첨가하여 세포를 해리시킵니다.

19 그리고 섭씨 37도에서 20 % 이산화탄소 5 %와 산소 5 %로 15 분 동안 배양합니다. 22 셀 현탁액을 300G에서 5분 동안 원심분리합니다. 23 그리고 펠릿을 1 밀리리터의 PDAC 매체에 다시 현탁시킵니다.

24 PDAC 매체로 iMEF 플레이트를 세척합니다. 25 그런 다음 50, 000 개의 렌티 바이러스 감염 PDAC 세포 26 웰 당 iMEF 플레이트의 5 웰에 추가하고, 이전에 입증 된 바와 같이 27 하룻밤 동안 배양한다. 28 재프로그래밍 매체를 준비한 후, 29는 100 마이크로리터의 염기성 섬유아세포 성장 인자 30 내지 100 밀리리터의 재프로그래밍 매체를 첨가한다.

31 다음날, iMEF 공급기에서 자라는 세포를 미리 따뜻해진 재프로그래밍 매체로 32 두 번 세척합니다. 33 그런 다음 각 우물에 2 밀리리터의 매체를 넣고 34 섭씨 37도에서 5 %의 이산화탄소와 3 %의 산소로 밤새 배양합니다. 36 IPSC 풀을 5번 통과한 후, 37은 ESC와 같은 형태를 유지하는 견고한 콜로니(38)를 관찰합니다.

39 PDAC, BxPc3, 40 H6c7 및 인간 섬유아세포(41)는 성숙한 ESC와 같은 형태를 형성하기 위해 42를 재프로그래밍하는 다른 날을 보여주었다. PDAC, 45 BxPc3, H6c7, 46 및 인간 섬유아세포 세포의 각 재프로그래밍으로부터 44 개의 클론 IPSC 라인이 확립되었습니다. 47 확립된 모든 IPSC 라인은 TRA-160에 대해 양성 48을 염색하여 다능성으로의 재프로그래밍을 확인했습니다.