먼저, PFF를 주입한 C57 흑색 생쥐 6마리의 파라핀 뇌 절편을 촬영합니다. 슬라이드를 자일렌 대용품에 담그고 2분 동안 배양하여 왁스를 제거합니다. 수분 보충을 위해 슬라이드를 100% 95% 및 70% 에탄올에 담근 다음 탈이온수에 두 번 담그십시오.
샘플을 이중 증류수와 함께 전자레인지용 용기에 옮깁니다. 100배 구연산염 완충액을 섭씨 4도에서 pH 6으로 데웁니다. 그런 다음 350ml의 신선한 구연산염 완충액을 준비합니다.
준비된 구연산염 완충액을 뚜껑이 있는 플라스틱 용기에 붓습니다. 슬라이드를 구연산염 완충 용기에 넣고 뚜껑을 고정합니다. 샘플을 전자레인지에 700와트로 4분 동안 돌린 다음 5분 동안 휴식을 취합니다.
전자레인지에 1.5분 더 돌린 후 5분간 휴지시킨 후 구연산염 완충액을 보충합니다. 전자레인지에 1.5분간 돌리고 5분간 휴지시킵니다. 그런 다음 샘플과 구연산염 완충액을 얼음 위에서 20분 동안 식히고 이중 증류수로 세척합니다.
티슈를 만지지 않고 종이 타월을 사용하여 샘플 슬라이드를 건조시킵니다. 팍펜을 사용하여 티슈 조각 주위에 직사각형을 그립니다. 이제 모든 슬라이드를 슬라이드 면역 염색 상자로 옮깁니다.
TBS-T로 여러 번 부드럽게 세척하여 TBS-T 방울이 PAP 펜 직사각형 안에 머물도록 합니다. 종이 타월의 슬라이드를 눌러 TBS-T를 제거합니다. 각 직사각형에 50 마이크로 리터의 블로킹을 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양합니다.
배양이 끝나면 종이 타월을 사용하여 샘플에서 차단 용액을 제거합니다. 1차 항체 혼합물 50마이크로리터와 TBS-T를 각 직사각형에 부드럽게 피펫팅하고 섭씨 4도에서 밤새 샘플을 배양합니다. 그런 다음 TBS-T로 슬라이드를 씻으십시오.
종이 타월을 두드려 TBS-T를 제거합니다. 이 과정을 세 번 반복합니다. 다음으로, TBS-T에서 1000 희석된 2차 항체 혼합물 50마이크로리터를 각 직사각형에 첨가하고 어두운 곳에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.
그 후, TBS-T로 샘플을 세 번 세척합니다. 그런 다음 TBS-T에서 밀리리터당 2마이크로그램의 농도로 DAPI로 샘플을 1분 동안 배양합니다. 종이 타월을 두드려 DAPI 용액을 제거하고 TBS-T로 세 번 씻습니다.
유리 커버 슬립을 장착하려면 장착 시약의 슬라이드당 두 방울을 샘플에 추가합니다. 커버 슬립을 부드럽게 눌러 기포를 제거하고 샘플을 실온에서 1시간 동안 건조시킵니다. 60배 오일 대물렌즈 또는 공초점 기술이 장착된 구조화된 조명 형광 이미징 시스템을 사용하여 다양한 분야에서 최소 50개의 세포를 이미징합니다.
세포를 분석하려면 양성 또는 음성 세포 주위에 등고선을 그리고 crop 함수를 사용하여 관심 영역을 분리하십시오. 다음으로, 형상 디스크립터를 활성화하고 측정 설정 기능에서 임계값 옵션을 제한합니다. 조정 메뉴에서 임계값 기능을 선택하여 임계값 수준을 조정합니다.
마지막으로 입자 분석 도구를 사용하여 미토콘드리아를 캡처할 적절한 크기를 설정합니다. 예를 들어, 크기를 25 무한대로 설정한 다음 픽셀 단위를 활성화하고 마스크 표시를 선택합니다."티로신 하이드록실라제 VDAC1, PS129 알파-시누클레인 및 DAPI에 대해 염색된 PFF 주입 마우스의 코-아미노의 실질적 니그라 파스 콤팩타가 표시됩니다. 반대로 PS129 알파 synuclein 염색은 건강한 세포에서 PS129 병변을 품은 세포를 감별하는 것을 허용했습니다.
티로신 하이드록실라제 양성 뉴런의 VDAC1 염색 이미지 분석은 PS129 병변이 있는 뉴런과 PS129 병변이 없는 뉴런 사이의 미토콘드리아 수 수와 종횡비가 모두 감소한 것으로 나타났습니다.
