시작하려면 분리된 혈장 샘플을 섭씨 37도에서 해동합니다. 각 혈장 샘플 100마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 각 튜브에 1mL의 무칼슘 HBSA 완충액을 추가합니다.
20에 표본, 4 섭씨 온도에 15 분 동안 000 g에 분리하십시오. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 20마이크로리터까지 흡인합니다. 다음으로, 칼슘이 없는 HBSA 완충액 1mL를 각 튜브에 첨가합니다.
그런 다음 피펫을 위아래로 움직여 펠릿을 재구성합니다. 세포외 소포체의 균등한 분포를 보장하기 위해 몇 초 동안 각 튜브를 소용돌이칩니다. 다음 20에 분리기, 4 섭씨 온도에 15 분 동안 000 g.
다시 말하지만, 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 20마이크로리터까지 흡인합니다. 그런 다음 80 마이크로리터의 무칼슘 HBSA 완충액에서 펠릿을 재구성합니다. 균일한 서스펜션을 얻기 위해 서스펜션을 위아래로 피펫팅합니다.
세포외 소포체 조직 인자 활성을 측정하기 위해 먼저 40마이크로리터의 세포외 소포체 샘플을 96웰 플레이트의 두 웰에 피펫팅합니다. 첫 번째 우물에 억제성 마우스 항인간 TF IgG 11마이크로리터를 추가합니다. 다른 웰에 11 마이크로리터의 대조군 마우스 IgG를 추가합니다.
배양 후 50 마이크로 리터의 인자 혼합 용액을 각 웰에 첨가하십시오. 접시를 필름으로 덮은 다음 섭씨 37도에서 2시간 동안 접시를 배양합니다. 25마이크로리터의 HBSA EDTA 완충액을 추가하여 Xa 인자 생성을 중지합니다.
증류수에서 발색 기질을 4 밀리몰의 농도로 재구성합니다. 이제 25 마이크로 리터의 발색 기질을 각 웰에 첨가하십시오. 접시를 필름으로 덮은 다음 알루미늄 호일로 감쌉니다.
접시를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 다음에, 1, 어떤 거품든지 제거하기 위하여 1 분 동안 500 g에 격판덮개를 분리하십시오. 그런 다음 플레이트를 405나노미터의 플레이트 리더에 놓습니다.
relipidated recombinant tissue factor로 생성된 표준 곡선을 사용하여 각 웰의 factor Xa 생성을 변환합니다. 그런 다음 조직 인자 종속 인자 Xa 생성을 계산합니다. 기증자 11명 중 6명은 중간에서 높은 지질다당류 반응자였고, 11명 중 5명은 저지방다당류 반응자였다.
