인간 유도 만능 줄기 세포의 간 분화를 시작한 지 27일 후, 웰당 2밀리리터의 PBS로 세포를 세척합니다. 주어진 성분을 사용하여 ADS 완충액에 효소 용액을 준비합니다. 6웰 플레이트의 웰당 1밀리리터의 용액을 추가합니다.
회전하는 셰이커에 섭씨 37도의 플레이트를 약 2시간 동안 올려 플레이트에서 세포를 분리합니다. 현미경으로 세포 분리를 확인한 다음 세포 현탁액을 피펫팅하여 단일 세포로 분산시키고 간세포 성숙 배지가 들어있는 50밀리리터 튜브에 수집합니다. 셀 현탁액을 섭씨 18도에서 5분 동안 200G에서 원심분리합니다.
그리고 흡입기를 사용하여 상층액을 제거합니다. 세포의 미토콘드리아를 염색하려면 100 나노몰 TMRM을 함유한 5밀리리터의 간세포 성숙 배지에 펠릿을 재현탁시킵니다. 세포를 빛으로부터 보호하면서 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.
다시, 세포 현탁액을 원심분리하고 펠릿을 2%FBS를 함유하는 1 내지 5밀리리터의 차가운 ADS 완충액에 재현탁시킨다. 세포 계수 후 500, 000 세포를 1.5 밀리리터 튜브에 분취하고 1 차 항체 대조군이 없는 것으로 표시합니다. 나머지 셀 현탁액을 200G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
100만 세포당 100마이크로리터의 희석된 1차 항체를 추가합니다. 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 튜브에 옮기고 얼음 위에서 50분 동안 배양합니다. 배양 후 세포 현탁액을 원심분리하고 2%FBS를 함유한 차가운 ADS 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다.
이제 100만 세포당 100마이크로리터의 희석된 2차 항체를 염색되거나 염색되지 않은 1차 항체에 추가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 다시 세포 현탁액을 원심분리하고 2%FBS를 함유한 차가운 ADS 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다. ADS 버퍼의 세포를 재현탁한 후 스냅 캡 세포 여과기를 통해 여과하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
