먼저, USDA 검사를 받은 정육점에서 얻은 적출된 눈을 멸균하고 해부하여 아이컵을 준비합니다. 내부가 위를 향하도록 아이컵을 세포 여과기가 들어 있는 페트리 접시에 부드럽게 넣습니다. 냉각된 DPBS를 아이컵에 추가하여 체액 레벨이 절개 부위의 가장 낮은 지점 바로 아래에 있도록 합니다.
손전등 아래에서 신경 망막이 망막 색소 상피에서 분리되기 시작하는 부분을 찾은 다음 뭉툭한 핀셋을 사용하여 들어 올려진 신경 망막을 부드럽게 잡고 벗겨냅니다. 시신경 디스크 근처의 신경 망막을 부드럽게 수집합니다. 진공 흡인 시스템에 부착된 목초지 피펫을 사용하여 신경 망막을 흡인합니다.
냉각된 DPBS를 조심스럽게 추가하여 흡기된 부피를 교체합니다. 이제 이 추가된 DPBS를 흡인하여 남아 있는 신경 망막을 제거합니다. 모든 아이컵에서 신경망막을 제거한 후 각 아이컵에 트립신을 부드럽게 추가하고 페트리 접시 뚜껑을 교체합니다.
섭씨 37도에서 이산화탄소 5%를 함유한 트립신으로 30분 동안 눈을 배양합니다. 손전등 아래에서 1,000 마이크로리터 피펫을 사용하여 각 안구에서 망막 색소 상피 세포를 부드럽게 제거합니다. 제거된 세포를 15밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다.
세포 배양 배지로 아이컵을 세척하여 남아 있는 세포를 수집하고 트립신을 중화합니다. 이러한 배지 함유 세포를 이전에 수집된 세포와 혼합합니다. 셀 현탁액을 실온에서 250G에서 5분 동안 원심분리합니다.
그런 다음 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거합니다. 각 세포 펠릿을 3 밀리리터의 D anase 작업 용액에 재현탁시킵니다. 세포 현탁액을 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 15분 동안 배양합니다.
그런 다음 실온에서 150G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 3mL의 신선한 세포 배양 배지에 재현탁시킵니다. 6개의 웰 플레이트 중 하나의 웰에서 2개에서 3개의 눈에서 얻은 세포를 옮기고 이를 통로 0으로 간주합니다.
그런 다음 씨를 뿌린 6개의 웰 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 가습 인큐베이터로 조심스럽게 옮깁니다. 원발성 망막 색소 상피 세포는 분리 후 3일 후에 특징적인 색소 침착이 뚜렷한 돼지 눈에서 분리되었습니다. 세포는 일주일 후에 완전한 합류를 달성했으며, 이는 건강한 단층을 나타냅니다.
비정상적인 형태 및 과도한 색소 침착을 나타내는 배양물은 오염된 것으로 인식되어 실험에 사용되지 않았습니다.
