먼저 멸균 1.7밀리리터 튜브 3세트와 멸균 15밀리리터 원추형 바닥 튜브 1세트에 라벨을 붙입니다. 15밀리리터 튜브 인서트가 있는 스윙 버킷 원심분리기를 준비하고 섭씨 4도까지 사전 냉각합니다. transfection된 293FT 세포가 있는 6웰 세포 배양 플레이트를 사용합니다.
우물에서 미디어를 흡인합니다. 250마이크로리터의 트립신-EDTA를 넣고 세포가 분리되기 시작할 때까지 37도에서 배양합니다. 그런 다음 10%FBS 보충 분석 배지 1mL를 각 웰과 피펫에 세게 추가하여 단세포 현탁액을 만듭니다.
1mL의 세포 현탁액을 사전 라벨링된 15mL 튜브로 옮깁니다. 이 튜브 각각에 10%FBS 보충 분석 매체 1밀리리터를 추가하고 5번 반전시켜 혼합합니다. 그런 다음 즉시 20 마이크로리터의 세포 현탁액을 튜브 세트 1로 옮깁니다.
이제 사전 냉각된 원심분리기에서 250g에서 15밀리리터 튜브를 5분 동안 원심분리합니다. 20 마이크로리터의 트리판 블루 세포 염색제를 세트 1의 세포와 혼합하고 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 계수합니다. 원심분리기에서 15밀리리터 튜브를 제거한 후 세포 펠릿에서 매체를 흡입하고 펠릿을 무혈청 분석 매체에 재현탁시켜 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
384웰 및 6웰 플레이트의 셀을 재생산하려면 15밀리리터 튜브를 여러 번 반전시켜 균질한 셀 현탁액을 만들고 세트 2 및 세트 3에서 500마이크로리터를 1.7밀리리터 튜브로 옮깁니다. 0.5 마이크로리터의 DMSO를 2세트 세트에 추가하고 0.5 마이크로리터의 Halo 618 리간드를 튜브 세트 3에 넣고 잘 섞습니다. DMSO 및 리간드 양성 세포 현탁액을 시약 저장소의 분리된 웰로 이송합니다.
멀티채널 피펫을 사용하여 각 현탁액 40마이크로리터를 384웰 배양 플레이트로 이송합니다. 후속 웨스턴 블롯 분석을 위해 나머지 세포를 새로운 6웰 배양 플레이트로 옮기고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 밤새 384웰 및 6웰 플레이트를 배양합니다. 섭씨 37도에서 사전 예열된 무혈청 분석 배지를 사용합니다.
해동된 나노루시페라아제 기질을 무혈청 분석 매체에 1:100으로 희석하고 시약 저장소로 옮깁니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 10마이크로리터의 기질 혼합물을 384웰 배양 플레이트의 각 웰로 이송합니다. 플레이트를 1분 동안 부드럽게 회전시킵니다.
384웰 플레이트를 다중 모드 플레이트 리더에 삽입하고 셀이 있는 모든 웰의 460 및 618나노미터 방출을 기록합니다. 주어진 방정식을 사용하여 차량 양성 및 리간드 양성에 대한 원시 BRET 비율을 milliBRET 단위로 계산합니다. 리간드 양성의 BRET 비율에서 차량 양성 BRET 비율을 빼서 수정된 BRET 비율을 계산합니다.
나노 CRAFS259A 돌연변이는 BRET 신호를 약 45% 감소시키고 나노 CRAFS621A 돌연변이는 약 25%를 감소시킵니다. 이중 돌연변이는 BRET 신호를 거의 제거합니다.
