경험 의존적 임계 기간 Synaptic Glomeruli Pruning을 분석하기 위한 공초점 이미징 및 시냅스 측정

시작하려면 슬라이드를 가져와서 두 개의 얇은 양면 접착 테이프 스트립을 추가하여 이미징을 준비합니다. 두뇌 장착을 위해 두 테이프 스트립 사이에 약 10-15 마이크로리터의 장착 매체를 피펫팅합니다. 라벨 Drosophila Brains를 PBS 및 0.2%Triton X-100으로 사전 헹궈진 P20 피펫 팁이 있는 현미경 슬라이드에 옮깁니다.

뇌가 이식되면 가는 붓을 사용하여 더듬이 엽이 위를 향하도록 정렬합니다. 뇌의 방향을 잡은 후 유리 커버슬립으로 덮습니다. 그런 다음 커버슬립의 측면을 추가 장착 매체로 채웁니다.

커버 슬립의 가장자리를 투명 매니큐어로 밀봉하십시오. 슬라이드를 완전히 건조시킨 후 후속 이미징을 위해 냉장고에 보관하십시오. 이미징을 위해 63X 오일 이멀젼 대물렌즈가 장착된 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하십시오.

아르곤 488 및 헬륨 네온 543 레이저를 사용하여 더듬이엽의 시냅스 사구체 및 Or42a 후각 감각 뉴런을 이미징합니다. 두 채널 모두에 대한 광학 게인과 오프셋을 결정합니다. 이미징을 뇌 중앙에 배치하고 VM7 사구체에 초점을 맞춥니다.

대략 뇌 중앙에 있는 구멍에 위치합니다. 1024 x 1024의 이미징 해상도를 선택합니다. 더듬이 로브를 통해 전체 공초점 Z 스택 투영을 캡처하여 VM7 사구체의 전체 Or42a 뉴런 신경 분포를 캡처합니다.

유전자형 또는 상태 맹검 영상을 피지에 불러옵니다. 레이저 라인 채널을 분할하려면 이미지로 이동하여 색상을 클릭하고 분할 채널을 선택합니다. Or42a 후각 감각 채널에서 Z 스택을 스크롤하여 Or42a 뉴런 신경 분포가 포함된 슬라이스를 확인하여 형광의 시작과 끝을 식별합니다.

Or42a 뉴런 신경이 분포된 슬라이스만 포함하는 합 슬라이스 투영법을 만들려면 이미지를 클릭하고 스택으로 이동합니다. 그런 다음 Z 프로젝트를 클릭하고 합계 슬라이스를 선택한 다음 원하는 범위를 입력합니다. 피지의 올가미 도구를 사용하여 VM7 사구체에서 Or42a 뉴런 신경 분포의 윤곽을 추적합니다.

추적된 영역의 둘레에 Z 스택 슬라이스의 수와 각 슬라이스의 두께를 곱하여 VM7 시냅스 사구체 신경 분포 부피를 계산합니다. 제어 냄새 차량에 24시간 노출된 후 밀도가 높은 Or42a MCD:GFP 신경 분포가 양쪽 더듬이 엽의 VM7 사구체에서 지속됩니다. 대조적으로, 25%EB 냄새 물질에 24시간 노출되면 상당한 가지치기와 시냅스 사구체 부피 손실이 발생합니다.

EB 냄새 농도가 증가하면 시냅스 사구체 가지치기가 점진적으로 증가합니다. 이 EB 냄새 농도 범위에 대한 대표적인 정량화는 형광 강도 및 신경 분포 부피에 대해 유사한 결과를 보여주었습니다.