시작하려면 층류 캐비닛을 켜서 3분 동안 안정화되도록 합니다. 다음 소독제를 사용하여 캐비닛의 내부 표면을 무균 세척하고 살균합니다. 캐비닛에 들어갈 물질을 소독한 후 냅킨과 니트릴 장갑을 캐비닛에 넣습니다.
그런 다음 캐비닛의 전원을 끄고 15분 동안 자외선에 노출시킵니다. 방사선 조사 후 캐비닛을 다시 시작하십시오. 프라이머 디자인 시약을 얼음이 채워진 쿨러에 넣습니다.
70 % 에탄올로 소독 한 후 용기를 캐비닛 안에 넣으십시오. 0.6밀리리터 미세원심분리기에서 루프 매개 등온 증폭 또는 LAMP 혼합물을 준비합니다. 혼합물을 균질화하기 위해 피펫팅합니다.
다음으로, 닫힌 튜브를 섭씨 95도의 가열 블록에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 얼음이 채워진 폴리스티렌 쿨러에서 튜브를 5분 동안 식힙니다. 냉각 후 튜브를 층류 캐비닛에 놓습니다.
LAMP 혼합물을 완성하려면 4마이크로리터의 DNA 중합효소를 첨가한 다음 1마이크로리터의 역전사 효소를 추가합니다. 비색 검출을 수행하려면 dihydroxynaphthol blue를 추가하십시오. 시약을 첨가한 후 각 용액을 피펫팅하여 LAMP 시약을 적절하게 혼합합니다.
다음으로, 용액 22 마이크로 리터를 PCR 튜브에 피펫팅하고 기포가 생성되지 않도록주의합니다. 음성 대조군의 경우 0.1% 디에틸 피로카보네이트 물 3마이크로리터를 추가합니다. 유전 물질을 추가하기 위해 남아 있는 튜브를 따로 보관하십시오.
그런 다음 캐비닛에서 모든 재료를 제거합니다. 캐비닛 표면을 70% 에탄올로 소독한 후 전원을 끄십시오. 별도의 영역에서 각 PCR 튜브에 3마이크로리터의 샘플을 추가하고 20마이크로리터 마이크로피펫으로 잘 피펫하여 완전히 균질화합니다.
비색 반응을 시작하기 전에 고품질 카메라를 사용하여 PCR 튜브의 사진을 찍습니다. 이제 열 순환기와 수조를 사용하여 반응을 수행하십시오. 열 순환기의 경우 튜브를 반응 블록에 배치하고 장비에 열 프로파일을 설정합니다.
수조를 사용하는 경우 튜브를 원형 용기에 단단히 넣은 다음 이 용기를 섭씨 66.3도의 수조에 60분 동안 넣습니다. 반응 시간이 끝나면 튜브를 제거하고 사용할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. 비색 반응이 수행된 경우 고품질 카메라로 PCR의 이미지를 캡처합니다.
온도 구배는 최적의 용융 온도가 섭씨 66.3도임을 보여주었습니다. BST 3.0 효소의 농도는 마이크로리터당 3.2 국제 단위로 최적화되었습니다. 비색 전략을 정의하기 위해, 중성 적색 염료의 페놀 레드를 평가했습니다.
그러나 증폭 후 색상 변화는 관찰되지 않았습니다. 다양한 농도의 히드록시나프톨 블루의 표준화는 125마이크로몰의 히드록시나프톨 블루에서 발생하는 최적의 변화로 수행되었습니다. 증폭된 샘플은 농도에 따라 색상의 변화를 보여주었습니다.
샘플 증폭은 전기영동에 의해 추가로 확인되었습니다.
