시작하려면 안락사된 쥐를 해부판에 놓습니다. 해부 T-핀을 사용하여 마우스의 발 패드를 보드에 고정합니다. 외과 용 해부 가위로 하복부를 절개하고 턱까지 자릅니다.
복막 내벽에서 피부를 분리한 후 몸통에서 수직으로 뻗어 핀으로 고정합니다. 뭉툭한 집게를 사용하여 자궁 경부, 축, 상완 및 서혜부 림프절과 비장을 조심스럽게 제거하고 2밀리리터의 R9 배지가 들어 있는 70마이크로미터 세포 여과기에 넣습니다. 단일 세포 현탁액을 준비하려면 조직 파괴 도구를 시계 방향과 시계 반대 방향으로 반복해서 반 바퀴 돌립니다.
5 밀리리터의 매체로 여과기를 씻으십시오. 그런 다음 셀 현탁액을 15밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 원심분리합니다. 상층액을 디캔팅한 후 튜브에 500마이크로리터의 용해 완충액을 추가하여 적혈구를 제거합니다.
1분 후 셀을 9.5ml의 R9 배지와 혼합합니다. 튜브를 원심분리합니다. 그리고 상층액을 철저히 디캔팅합니다.
다음으로, 항-MHC2 및 항-CD4 항체를 함유하는 10밀리리터의 음성 선택 배지에 세포 펠릿을 재현탁시키고 튜브를 30분 동안 로커에 넣습니다. 270G에서 5분 동안 세포를 펠릿화한 후 상층액을 디캔팅합니다. 동시에 15 밀리리터 원뿔형 튜브에서 200 마이크로 리터의 양 안티 랫트 및 면역 글로불린 G 비드를 7 밀리리터의 매체에 세척합니다.
튜브를 자석에 놓고 매체를 제거합니다. 두 번 더 세척한 후 비드를 7ml의 R9 매체에 재현탁시킵니다. 그런 다음 7ml의 비드 현탁액을 세포 펠릿과 혼합하고 로커에서 튜브를 배양합니다.
항체 비드 결합 세포를 제거하려면 원추형 튜브를 자석에 직접 3분 동안 놓습니다. 셀 현탁액을 새 15밀리리터 튜브에 흡입하여 튜브를 자석에 고정합니다. 농축된 CD8 양성 세포를 펠릿화하고 매체에서 세 번 세척합니다.
