유전자 전달을 위한 렌티바이러스 입자의 Sucrose Density Gradient Based Purification of Lentivirus particles 유전자 전달을 위한 Sucrose Density Gradient Based Purification of Lentivirus particles 유전자 전달을 위한 렌티바이러스 입자

먼저 50밀리리터 주사기에서 플런저를 제거하고 단백질 결합이 낮은 폴리에테르설폰 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드 0.45마이크로미터 멸균 필터를 주사기 끝에 삽입합니다. 25ml의 혈청학적 스트리펫을 사용하여 렌티바이러스 형질주입된 HEK293T 세포 현탁액을 주사기에 넣고 플런저를 부드럽게 되돌립니다. 플런저를 천천히 밀고 새 50밀리리터 튜브에 여과액을 모읍니다.

완료되면 주사기에서 필터를 제거하고 오염 제거 용액에 폐기합니다. 20% 자당 용액 3ml를 초원심분리기 튜브 바닥에 추가합니다. 그런 다음 PIPETBOY를 가장 낮은 속도로 설정합니다.

초원심분리기 튜브를 약 45도 각도로 잡고 여과된 렌티바이러스 함유 매체를 튜브 벽에 천천히 추가합니다. 튜브에서 층이 명확하게 분리되는 것을 관찰하십시오. 총 튜브 부피가 29밀리리터 미만인 경우 탈수 중에 튜브가 무너지지 않도록 새 cDMEM을 추가합니다.

초원심분리기 버킷을 70% 알코올로 닦고 튜브 어댑터를 버킷 바닥에 넣습니다. 그런 다음 초원심분리기 튜브를 양동이에 넣습니다. 버킷을 닫고 랙에 넣습니다.

초원심분리기를 섭씨 4도로 사전 냉각합니다. 버킷을 로터에 조심스럽게 넣고 진공 청소기를 켭니다. 26, 4 섭씨 온도에 90 분 동안 000 분당 회전수 가장 낮은 조정 그리고 분리기에 가속도 그리고 감속 비율을 조정하십시오.

원심분리 후에는 진공을 끄고 샘플을 방해하지 않고 로터를 조심스럽게 제거합니다. 초원심분리기를 관찰하여 양동이에서 엎지르거나 새는 것이 없는지 확인하십시오. 초원심분리기 튜브의 내용물을 한 번의 부드러운 동작으로 폐기물 용기에 붓습니다.

튜브를 이중층 티슈 페이퍼에 뒤집어 10분 동안 사용합니다. 한편, 70% 에탄올에 적신 티슈로 양동이 내부를 닦고 거꾸로 자연 건조시킵니다. 티슈 페이퍼를 사용하여 초원심분리기 튜브 가장자리에 남아 있는 액체를 조심스럽게 건조시킵니다.

펠릿을 적절한 무혈청 배지 1mL에 재현탁시키고 15분 동안 그대로 두십시오. 1밀리리터 피펫을 사용하여 렌티바이러스 제제를 부드럽게 혼합하고 1.5밀리리터 스크류 탑 튜브에 분주합니다. 렌티바이러스 제제는 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

성공적인 렌티바이러스 제제는 5마이크로리터 용량으로 95% 이상의 감염률을 달성했습니다. 감염된 세포의 평균 형광 강도는 투여량이 높을수록 증가합니다. 100 마이크로리터의 렌티바이러스 제제를 복강내 주입한 결과, 생쥐 복막 세포에서 GFP 신호의 가장 높은 비율과 강도가 나타났습니다.

100 마이크로리터 렌티바이러스 주입을 사용한 시간 경과 실험에서 3일째와 7일째에 GFP 발현 거주 세포의 상당한 비율이 나타났고, 14일째에 감염 집단이 사라졌습니다.