CRISPR 기반 모듈러 어셈블리 또는 CRISPRmass의 병렬 2단계 시험관 반응을 수행하려면 시험관 반응 1단계에서 Cas9 sgRNA에 의해 cDNA/ORF 플라스미드의 동일한 벡터 백본을 절단합니다. 이렇게하려면 얼음 위의 알루미늄 냉각 블록에 적절하게 표시된 0.2 밀리리터 튜브를 배열하십시오. 적절한 양의 Cas9, sgRNA, Cas9 완충액 및 DEPC 처리수를 혼합하여 N회 반응에 대비한 마스터 믹스를 준비합니다.
마스터 믹스의 구성 요소가 함께 추가되면 적절한 혼합을 보장하기 위해 동일한 와류를 발생시킵니다. 그런 다음 혼합물을 스핀 다운하고 마스터 혼합물 2 마이크로 리터를 각 0.2 밀리리터 튜브에 분주합니다. 다음으로, 각 튜브에 0.4 마이크로리터의 0.019 마이크로몰 cDNA/ORF 플라스미드를 추가합니다.
섭씨 37도에서 1시간 동안 분열 반응을 배양합니다. 다음 시험관 반응, 2단계에서는 벡터 특이적 UAS 모듈을 결과 Cas9 선형화된 cDNA/ORF 플라스미드에 삽입합니다. 각 샘플에 대해 1.4 마이크로리터 단일 단계 반응을 설정하려면 라벨이 부착된 0.2 밀리리터 튜브를 얼음 위의 알루미늄 냉각 블록에 배열합니다.
적절한 양의 UAS 모듈과 단일 단계 반응 어셈블리 마스터 믹스를 혼합하여 N개의 반응에 대한 마스터 믹스를 준비합니다. 스핀다운하기 전에 혼합물을 잘 소용돌이치십시오. 그런 다음 마스터 혼합물 0.77 마이크로 리터를 각 튜브에 분취합니다.
각 튜브의 부분 표본에 0.7 마이크로리터의 Cas9 선형화된 cDNA/ORF 플라스미드를 추가하고 섭씨 50도에서 1시간 동안 반응을 배양합니다.