시작하려면 분화된 THP-1 세포를 얻고 배양 플레이트의 웰에서 사용된 배지를 제거합니다 PBS로 세포를 세척한 후 지질 다당류(LPS)를 함유한 무혈청 배지를 세포에 추가하고 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 아데노신 삼인산 또는 ATP 원액을 모델 그룹에 추가하고 이산화탄소 5%로 섭씨 37도에서 45분 동안 플레이트를 배양합니다. 다음으로, 배양 플레이트의 우물에서 모든 상층액을 흡인합니다.
PBS로 세포를 두 번 세척한 후 EDTA가 없는 0.05%트립신 500마이크로리터를 각 웰에 넣고 30초 동안 배양합니다. 세포 분리를 중지하려면 1ml의 RPMI 1640 배지를 추가하고 세포를 5milliter 튜브에 옮깁니다. 튜브를 300G에서 실온에서 3분 동안 원심분리합니다.
1 밀리리터 PBS로 세포를 다시 부유시킨 후 세포가 있는 튜브를 섭씨 37도의 수조에 3분 동안 넣고 원심분리합니다. 세포를 다시 현탁시키려면 100마이크로리터의 1X 결합 완충액을 추가하고 세포를 새로운 5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 대조군과 모델 튜브를 실온의 어두운 곳에서 적절한 시약으로 배양합니다.
배양을 종료하려면 튜브에 400마이크로리터의 PBS를 추가하고 부드럽게 소용돌이칩니다. 5밀리리터의 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에 고정된 35마이크로미터 나일론 메쉬로 셀 현탁액을 여과합니다. 깨끗한 커버 유리를 크롬 명반 용액에 2시간 동안 담그고 섭씨 37도의 오븐에서 건조시킵니다.
앞서 설명한 것처럼 트립신화된 세포를 펠렛화하고 500마이크로리터의 전자 현미경 고정액으로 세포를 실온에서 2시간 동안 고정한 다음 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 고정 용액에서 세포를 채취한 후 실온에서 3분 동안 300G으로 펠릿화합니다. 100 마이크로리터의 PBS를 넣고 세포를 부드럽게 불어냅니다.
셀 현탁액을 커버 유리에 떨어뜨리고 5분 동안 그대로 두십시오. 모든 상층액을 흡인하고 PBS로 세포를 각각 5분 동안 세 번 세척합니다. 500 마이크로 리터의 1 % osmic acid 고정 용액을 추가하십시오.
한 시간 후 모든 상층액을 흡인합니다. PBS를 세 번 세척한 후 에탄올 농도를 높인 상태로 샘플을 탈수합니다. 임계점 건조기를 켜고 이산화탄소 탱크를 연 다음 챔버를 섭씨 10도로 냉각합니다.
필터를 사용하여 샘플을 빠르게 감싸고 챔버 압력이 평방 인치당 0파운드일 때 챔버에 넣습니다. 온도가 섭씨 35도까지 안정화되고 압력이 1, 평방 인치당 250파운드에 도달하면 분당 평방 인치당 100파운드로 감압합니다. 챔버 압력이 0일 때 샘플을 꺼냅니다.
마지막으로 전도성 테이프를 사용하여 스퍼터 코더를 사용하는 알루미늄 표본 홀더인 주사 전자 현미경에 표본을 장착합니다. 샘플을 2-5 나노미터의 금 층으로 덮습니다. 유세포 분석 결과 LPS/ATP 자극 후 QT 영역의 세포가 크게 증가하여 세포 사멸을 나타내는 것으로 나타났습니다.
원형질막 표면의 주사 전자 현미경 사진에서 LPS/ATP 자극 세포에서 막 출혈 및 파열을 포함한 pyroptosis의 특징이 나타났지만 대조 세포는 정상으로 보였습니다. 또한, LPS/ATP 자극은 세포막의 출혈, 세포 수축 등의 세포사멸 특성을 나타내고, 세포 팽윤 및 막파열 등의 괴사(necroptosis) 특성을 가진 세포가 관찰되었습니다.
