과산화수소 유도 MCF-7 세포 배양을 생성한 후 배양 접시에서 상층액을 버립니다. PBS 1ml를 넣고 PBS를 버리기 전에 접시를 부드럽게 흔듭니다. 이제 트립신 1밀리리터를 넣어 세포를 세척하고 접시를 흔들어 1분 동안 기다린 다음 트립신을 버립니다.
접시를 부드럽게 두드리고 시트의 세포 움직임을 관찰하여 분리를 확인합니다. 다음으로, 4ml의 완전한 배양 배지를 추가하고 세포 현탁액을 15ml의 원심분리 튜브에 옮깁니다. 현탁액을 800G에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
200 마이크로리터의 PBS를 첨가하여 펠릿을 재현탁시키고 셀 현탁액을 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그 후, 세포를 파괴하기 위해 반복적인 동결-해동 주기를 수행합니다. 세포 용해물을 1500G에서 10분 동안 원심분리하고 분석을 위해 상층액을 수집합니다.
분석을 시작하기 전에 ELISA 시약을 실온에서 20분 동안 해동하고 ELISA 리더를 사용하기 15분 전에 예열합니다. 필요한 20배 농축 세척 버퍼를 탈이온수로 희석하여 작업 용액에 넣습니다. 표준 샘플의 작업 용액을 준비하고 기포가 형성되지 않도록 위아래로 조심스럽게 혼합합니다.
블랭크 웰을 제외한 다양한 농도의 표준 작업 용액 및 검출 샘플 50마이크로리터를 반응 웰에 추가하고 각 반응 웰에 100마이크로리터의 양고추냉이 과산화효소 접합 검출 항체를 추가합니다. 플레이트 씰로 웰을 밀봉하고 섭씨 37도에서 60분 동안 배양합니다. 배양 후 항체 용액을 제거합니다.
우물에 남아 있는 액체를 털어내고 흡수성 종이를 두드려 말리십시오. 각 반응 웰에 350 마이크로리터의 세척 완충액을 추가합니다. 1-2분 후, 50 마이크로리터의 기질 A와 B를 각 반응 웰에 추가하기 전에 완충액을 폐기합니다.
접시를 밀봉하고 어둠 속에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 15분 후, 각 반응 웰에 50마이크로리터의 정지 용액을 추가합니다. ELISA 리더를 사용하여 450나노미터 파장에서 광학 밀도 값을 즉시 측정할 수 있습니다.
MCF-7 세포의 생존력에 대한 과산화수소의 영향은 0.75 밀리몰로 12 시간 동안 처리하면 생존력이 67%로 감소하는 것으로 나타났으며, 1.5 밀리몰의 더 높은 농도에서 과산화수소 처리의 농도 증가 후 세포 생존율이 3% 미만으로 급격히 떨어졌고, 이는 8-Oxo-dG 수치가 증가하여 DNA 손상에 대한 산화 스트레스의 영향을 보여줍니다.
