pH 프로파일링을 위해 사전에 준비된 인간 위 오가노이드를 얻을 수 있습니다. 시작하려면 커넥터를 통해 기준 전극을 pH 전극 케이블에 연결합니다. 그런 다음 미세 전극을 증폭기에 연결하고 증폭기를 USB 케이블을 통해 소프트웨어를 사용하여 접지된 PC에 연결합니다.
미세 전극과 기준 전극을 탈이온수에 넣어 두 팁을 액체에 1cm 이상 담그십시오. 50밀리리터 원뿔형 튜브를 원하는 보정 버퍼로 채웁니다. 섬세한 실험실 물티슈를 사용하여 기준 전극과 함께 보호 튜브를 부드럽게 닦아냅니다.
소프트웨어를 연 후 보정 탭에서 Y-Zoom 상자를 선택한 다음 센서 신호 판독값을 밀리볼트로 설정합니다. pH 4.01 버퍼의 전극부터 시작하여 알려진 pH 값으로 4.01을 입력합니다. 밀리볼트 판독값이 안정화되면 Add point를 선택한 다음 두 전극을 탈이온수에 다시 넣어 헹굽니다.
pH 9.21 버퍼에 대해 이 과정을 반복한 후 신호가 약 83밀리볼트에서 안정되면 포인트 추가를 클릭합니다. 미세 전극이 2점 검량선에 대해 pH 4.01과 9.21 사이에서 선형으로 반응하는지 확인합니다. 보호 케이스를 벤치에 조심스럽게 평평하게 놓고 빠르고 빠른 동작으로 케이스를 당겨 미세 전극을 제거합니다.
미세전극을 미세매니퓰레이터에 장착하고 스테레오스코프와 마이크로매니퓰레이터를 배치하여 미세전극이 배양 접시 쪽으로 자유롭게 나아갈 수 있도록 합니다. 프로파일링을 위해 오가노이드가 들어 있는 배양 접시를 배치합니다. 기준 전극을 cl에 가볍게 고정합니다.amp 스테레오스코프 왼쪽에 있는 링 스탠드에 있습니다.
미세 전극의 끝이 매체에 충분히 잠길 때까지 육안으로 전진시킵니다. 신호가 안정화되면 매체의 pH 판독값을 3회 기록합니다. 그런 다음 오가노이드를 건드리지 않고 미세전극을 ECM으로 천천히 전진시킵니다.
평균을 계산하기 위해 최소 3개의 pH 판독값을 기록하십시오. 오가노이드 표면에 수직 축을 따라 미세 전극을 배치하고 기저측 오가노이드 표면을 관통하지 않고 부드럽게 움푹 들어간 곳을 만듭니다. 미세전극을 오가노이드로 조심스럽게 전진시키고 루날 pH를 측정합니다.
완료 후 다음 오가노이드에 대한 pH 측정을 진행합니다. 청소할 전극을 보호 튜브에 다시 넣습니다. 탈이온수, 에탄올 및 완충액으로 전극을 연속적으로 세척합니다.
기준 전극을 3몰 염화칼륨 용액으로 채워진 비커에 넣습니다. 2마이크로리터 유리 모세관에 멸균 미네랄 오일을 다시 채우고 마이크로매니퓰레이터로 제어되는 나노리터 자동주입기에 로드합니다. 마지막으로 0.02 % 메틸 레드와 150 밀리 몰 염산을 함유 한 용액으로 채우고 9.2 나노 리터의 용액으로 주입합니다.
동일한 배양 플레이트에 있는 10개의 오가노이드에서 루날 pH의 변화는 약 8.16으로 일관되게 측정되어 최소화되었습니다. 5개의 서로 다른 오가노이드 라인에 대한 내강 내 pH는 각 배양 내에서 일관되었지만, 오가노이드 라인 간에 상당한 변동이 관찰되었습니다. 오가노이드 루미날 pH는 ECM보다 일관되게 낮았으며, 이는 다시 배지의 pH보다 낮았으며, 이는 루노이드 pH가 생리학적으로 관련이 있으며 주변 배양 환경에 의해서만 결정되는 것이 아님을 시사합니다.
오가노이드 루멘에 메틸 레드를 주입한 결과 pH가 6.2 이상임을 확인했으며, 이는 거의 중성에 가까운 pH를 보여준 미세전극 측정과 일치했습니다.
