시작하려면 마이크로 튜브에 1.5 밀리리터의 70 % 에탄올을 30 밀리그램의 0.7 마이크로 미터 텅스텐 입자를 첨가하십시오. 혼합물을 13, 200G에서 15분 동안 원심분리합니다. 입자에 1.5ml의 멸균수를 첨가한 다음 다시 와류와 원심분리기를 합니다.
상층액을 버린 후 텅스텐 입자에 500 마이크로 리터의 멸균 50 % 글리세롤을 첨가하십시오. 입자를 코팅하려면 먼저 미토콘드리아 서열을 포함하는 2미크론 플라스미드 5마이크로그램과 박테리아 플라스미드 15마이크로그램을 얼음 위에 놓인 마이크로튜브에 추가합니다. 100 마이크로 리터의 텅스텐 입자 현탁액을 튜브와 와류에 첨가하십시오.
그런 다음 4 마이크로 리터의 1 몰 스퍼미딘과 소용돌이를 다시 첨가하십시오. 이제 100 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 2.5 몰 염화 칼슘을 튜브에 피펫팅합니다. 현탁액을 잠시 소용돌이치게 한 후 10분 동안 얼음 위에서 배양합니다.
텅스텐 입자를 13, 200G에서 섭씨 4도에서 30 초 동안 원심 분리한다. 그런 다음 섭씨 영하 20도에서 200% 에탄올 100마이크로리터로 입자를 세척합니다. 마지막으로, 텅스텐 입자를 60-70 마이크로 리터의 실온 100 % 에탄올에 다시 현탁시킨다.
생물학적 물질을 준비하려면 멸균된 매크로캐리어 홀더 6개를 멸균 유리판에 놓습니다. 한 쌍의 멸균 겸자를 사용하여 6개의 마크로캐리어 홀더 각각에 마크로캐리어를 삽입합니다. 10 마이크로 리터의 DNA 코딩 텅스텐 입자를 각 매크로 캐리어 표면에 피펫하고 피펫 팁으로 전체 표면에 고르게 분포시킵니다.
로 제로 효모 수용체 균주를 YPR 배지 2ml에 접종합니다. 회전하는 바퀴에서 섭씨 30도에서 밤새 배양액을 성장시킵니다. 다음 날, 300 마이크로리터의 배양액을 30 밀리리터의 신선한 YPR 배지가 들어있는 튜브에 옮깁니다.
배양액이 포화될 때까지 섭씨 30도에서 분당 200회 회전하여 2박 동안 회전식 셰이커에 배양액을 놓습니다. 효모 세포를 600G에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버린 후 600마이크로리터의 YPD 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다.
이제 멸균 유리 손잡이를 사용하여 100마이크로리터의 효모 세포 현탁액을 고체 충격 매체 플레이트에 펴 바릅니다. 모든 배양액을 퍼뜨린 후 폭격하기 전에 1-3 시간 동안 실온에서 플레이트를 배양하십시오.
