먼저 피펫을 사용하여 박층 크로마토그래피(TLC) 플레이트의 맨 아래 줄에 표시된 점에서 각 추출물의 5마이크로리터를 2cm 간격으로 찾습니다. TLC 플레이트에서 반점을 말리고 각 추출물 약 5mg이 플레이트에 로드될 때까지 반복합니다. TLC 개발 탱크에서 디클로로메탄과 메탄올의 1:2 용액을 준비합니다.
TLC 플레이트를 현상 탱크에 넣고 용매가 플레이트 상단에서 2cm 떨어진 선에 도달할 때까지 현상합니다. 현상이 완료되면 탱크에서 TLC 플레이트를 제거합니다. 즉시, 용매 라인 위의 점들에 있는 양성 대조군을 찾아냅니다.
모든 용매가 증발하기 전에 플레이트를 에탄올 멸균 TLC 플레이트 상자에 넣습니다. 멸균 금속 주걱을 사용하여 5개의 병원균 플레이트의 균사체 매트를 긁어냅니다. 그런 다음 50밀리리터 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
한천으로 수정한 감자 포도당 육수 25ml를 첨가한 후 멸균 유리 구슬을 튜브에 넣고 5분 동안 소용돌이쳐 균사체 매트를 분해합니다. 후드에 크로마토그래피 분무기를 조립한 후 튜브를 부착합니다. 그런 다음 유량계를 설정에 부착합니다.
바늘 끝이 있는 멸균 주사기를 사용하여 균사체 현탁액을 크로마토그래피 분무기로 옮기면 큰 균사체 조각이 분무기가 막히지 않습니다. 미디어 서스펜션을 적용하면서 이전에 개발된 TLC 플레이트를 층류 후드의 멸균 종이 타월에 놓아 플레이트와의 손 접촉을 줄입니다. 병원균 샘플을 조립된 분무기에 연결하고 TLC 플레이트에 현탁액을 세 번 코팅하여 플레이트가 적용 사이에 완전히 건조되도록 합니다.
다음으로, 멸균된 플라스틱 플레이트 상자에 50mL의 멸균수를 추가하여 배양 설정을 준비합니다. TLC 플레이트가 앉을 수 있도록 4개의 페트리 플레이트를 놓습니다. 또한 멸균된 접힌 셀룰로오스 시트나 여과지를 상자의 양쪽에 놓아 수분을 유지합니다.
완성된 분석 플레이트를 상자에 있는 4개의 빈 페트리 접시에 놓습니다. 3일에서 1주일 동안 또는 양성 대조군 및 억제 영역 주변을 제외하고 플레이트 전체에 균사체가 균일하게 자랄 때까지 분석을 배양합니다. 그런 다음 금속 숟가락을 사용하여 억제 영역에서 실리카를 긁어내고 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.
각 튜브와 소용돌이에 500마이크로리터의 메탄올을 첨가하여 실리카에서 대사 산물을 추출합니다. 튜브를 원심분리하여 실리카를 펠릿화하고 분석을 위해 상층액을 액체 크로마토그래피 바이알로 옮깁니다. 자외선 하에서의 이미징은 TLC 플레이트에서 대사 산물의 분리를 보여주었습니다.
배양 후, 병원체는 양성 대조군과 억제 구역을 제외하고는 전체 플레이트에 걸쳐 고르게 성장하는 것으로 나타났습니다.
