시작하려면 컴퓨터에 최신 버전의 Fiji를 다운로드하여 설치하십시오. convert_to_TIFF 다운로드 한 후. py 스크립트에서 스크립트를 피지로 드래그 앤 드롭하고 코드를 실행합니다.
실험이 저장된 경로로 이동합니다. 변환된 TIFF 파일은 동일한 실험 폴더 내에 생성됩니다. 플러그인을 클릭한 다음 3D Suite를 클릭하고 3D 관리자 옵션을 엽니다.
3D 관리자 창에서 볼륨(단위), 평균 회색 값, 바운딩 박스(픽셀), 표준 편차 회색 값, 픽셀 단위의 중심 및 단위의 중심에 해당하는 확인란을 선택합니다. XY 가장자리의 개체 제외를 선택하고 Z번째 가장자리의 개체를 제외합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. 인간 T-림프구의 형광 이미지를 엽니다.
Control Shift D를 클릭하여 스택을 포함한 단백질 채널을 복제합니다. 하이퍼 스택 확인란을 선택합니다. 채널 상자 내에서 적절한 채널 번호를 지정하고 그에 따라 이름을 바꿉니다.
Fiji 매크로 레코더를 시작하려면 플러그인으로 이동한 다음 매크로로 이동하여 기록을 선택합니다. 그런 다음 FindFoci 플러그인을 열려면 GDSC, FindFoci 및 FindFoci GUI 플러그인을 순차적으로 클릭하십시오. 이미지 드롭다운 메뉴에서 분석할 이미지를 선택합니다.
가우시안 블러를 1.5로, 배경 방법을 평균 위의 표준 편차로, 배경 매개 변수를 9로, 검색 방법을 최대 배경의 비율로, 검색 매개 변수를 0.7로, 피크 방법을 배경보다 상대적으로 높은 수준으로, 최대 매개 변수를 0.2로, 최소 크기를 5로 설정합니다. 최대 피크를 높은 숫자로 설정하여 이미지의 모든 초점을 포함합니다. 초점 식별을 향상시키려면 초점 지름에 가깝게 가우시안 블러를 조정하고 배경 매개변수의 값을 늘려 더 엄격한 임계값을 적용합니다.
그런 다음, 형광 피크에서 더 멀리 떨어진 영역을 포함하도록 검색 파라미터의 값을 줄이고 피크 분리를 위한 피크 파라미터의 값을 줄입니다. FindFoci를 실행하고 레코더 창에 나타나는 문자열을 복사합니다. 문자열에는 따옴표를 제외하고 선택한 매개 변수가 포함됩니다.
nuclear_prod_q. py 스크립트를 다운로드한 후 스크립트를 Fiji로 드래그 앤 드롭하고 실행을 클릭하여 코드를 실행합니다. 핵 채널에는 DAPI의 채널에 해당하는 번호를 입력합니다.
nucleus Gaussian blur의 경우 분할을 위해 이미지를 흐리게 하는 데 필요한 sigma 값을 입력합니다. 그런 다음 단백질 채널에 대한 관심 염색 채널에 해당하는 번호를 입력합니다. FindFoci 매개변수에 선택한 매개변수의 매크로 기록을 나타내는 문자열을 붙여넣습니다.
시각적 확인란을 선택하고 찾아보기를 클릭하여 이미지가 저장된 디렉토리를 선택합니다. 모든 상자가 컴파일되면 확인을 클릭하여 실행을 계속합니다. ROI Manager 3D 창의 ROI 목록에서 핵 채널을 선택하고 실시간 ROI를 클릭하여 켭니다.
동일한 핵에 속하는 ROI를 선택하고 병합을 누릅니다. 원하지 않는 핵의 경우 삭제를 누릅니다. 다시 라이브 ROI를 클릭하여 켜고, 모두를 선택하고, 모든 핵이 올바르게 분할되었는지 확인합니다.
quantification 폴더에서 분석에 사용된 파라미터 기록이 있는 TXT 파일을 엽니다. 브라우저에서 Google Colab을 엽니다. 그런 다음 파일에서 노트북 열기를 선택하고 최종 핵 단백질 메트릭을 업로드합니다.
ipynb 스크립트. 각 이미지 필드의 CSV 파일이 포함된 모든 폴더를 Google 드라이브의 원하는 폴더에 업로드합니다. Notebook에서 결과 하위 폴더가 저장된 폴더의 경로를 표시하고 모든 셀을 실행합니다.
코드 컴파일이 완료되면 컴파일된 모든 데이터가 포함된 최종 스프레드시트 파일을 엽니다.
