먼저 멸균 HBSS가 들어 있는 100mm 유리판에서 신선한 인심방 샘플을 세척합니다. 플레이트의 샘플을 부드럽게 흔들어 잔류 혈액을 제거합니다. 소량의 HBSS가 적신 100mm 플레이트로 샘플을 옮깁니다.
교차 메스를 사용하여 샘플을 2mm 크기의 입방체로 자릅니다. 다음으로, 4개의 작은 심근 조각을 35mm 플레이트에 옮깁니다. 파편 위에 멸균 커버 유리를 놓고 부드러운 압력을 가합니다.
플레이트에 1.5ml의 DMEM을 피펫팅합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 이산화탄소 보충이 5% 미만인 배양 플레이트를 배양합니다. 배양액이 85% 밀도에 도달하면 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 멸균 겸자를 사용하여 커버 유리를 들어 올립니다.
그런 다음 새 35mm 플레이트에 거꾸로 놓습니다. 그런 다음 멸균 PBS를 추가하여 헹굽니다. 이제 심근 조각을 제거하십시오.
그런 다음 플레이트에서 DMEM을 피펫팅합니다. 멸균 PBS를 사용하여 자란 세포가 들어 있는 플레이트를 헹굽니다. 헹굼을 버린 후 각 접시에 0.25% 트립신 EDTA 1mL를 넣고 접시를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 5분 동안 배양합니다.
배양 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 현미경을 사용하여 세포 박리를 확인합니다. 다음으로, 각 플레이트에 2ml의 트립신 정지 용액(TSS)을 추가하여 트립신화를 차단합니다. 세포 현탁액을 멸균된 15mL 튜브로 옮깁니다.
400G에서 4°C에서 5분간 원심분리합니다. 5ml의 혈청학적 피펫을 사용하여 상층액을 흡입합니다. 그런 다음 펠릿에 3ml의 DMEM을 추가하고 재현탁시킵니다.
셀 현탁액을 60mm 플레이트에 놓습니다. 섭씨 37도에서 이산화탄소 보충 5% 미만으로 세포를 배양합니다. 다음으로, 각 60mm 플레이트에 멸균 0.2% 젤라틴 용액 3ml를 피펫팅합니다.
배양 후 용액을 흡인하고 추가 사용할 때까지 3ml의 멸균 PBS를 추가합니다. 인큐베이터에서 심장 섬유아세포가 들어 있는 플레이트를 꺼냅니다. 플레이트에서 DMEM을 제거하고 멸균 PBS로 헹굽니다.
헹굼을 버린 후 각 접시에 0.25%trypsin EDTA 1mL를 추가합니다. 현미경을 사용하여 세포 박리를 확인합니다. 다음으로, 각 플레이트에 2ml의 TSS를 추가하여 트립신화화를 차단합니다.
세포 현탁액을 멸균된 15mL 튜브로 옮깁니다. 400G에서 4°C에서 5분간 원심분리합니다. 5ml의 혈청학적 피펫을 사용하여 상층액을 흡입합니다.
그런 다음 펠릿에 3ml의 DMEM을 추가하고 재현탁시킵니다. 60mm 젤라틴 코팅 플레이트에서 PBS를 제거하고 셀 현탁액을 플레이트에 놓습니다. 최대 21일 동안 융합 상태에서 섬유아세포를 배양합니다.
배양 21일 후 배양 배지를 흡인합니다. 그런 다음 PBS 3ml로 접시를 헹굽니다. PBS를 흡입하고 1밀리리터의 탈세포화 용액을 첨가한 후 도립 조영 현미경으로 플레이트를 관찰합니다.
2분 후, PBS 4ml를 부드럽게 피펫팅하여 플레이트의 탈세포화 용액을 희석합니다. 희석된 용액을 흡인합니다. 그런 다음 PBS로 접시를 부드럽게 헹굽니다.
마지막으로 플레이트에 PBS 1밀리리터를 추가합니다. 세포외 기질 코팅 플레이트는 나중에 사용할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. 배양물에 배치된 천연 심근의 작은 조각에서 섬유아세포의 성장은 3일에서 5일 이내에 관찰되었습니다.
탈세포화(decellularization)는 플레이트 표면에 세포외 기질 코팅을 초래했습니다. in vitro에서 생산된 심장 세포외 기질의 구성 및 구조는 탈세포화(decellularization)로 인해 보존되었습니다.
