먼저 실온에서 10밀리리터 전혈관을 10회 부드럽게 뒤집습니다. 스윙 버킷 로터를 사용하여 브레이크를 켠 상태에서 섭씨 22도에서 800g의 튜브를 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 샘플을 생물 안전 작업대에 넣고 세 개의 뚜렷한 층이 있는지 확인합니다.
문자 A, B 및 C.Swirl로 3개의 5밀리리터 폴리스티렌 튜브에 라벨을 붙이고 흡인으로 버피 코트 1밀리리터를 수집하고 A로 표시된 튜브로 옮긴 다음 버피 코트가 포함된 튜브 A에 0.1몰 EDTA 60마이크로리터를 추가합니다. 50 마이크로리터의 칵테일 믹스를 튜브 A.피펫에 위아래로 3회 이상 첨가하여 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그 후, 튜브 A에 890 마이크로리터의 PBS를 추가하고 피펫팅으로 3회 이상 혼합합니다.
그런 다음 마그네틱 비드 튜브를 30초 동안 소용돌이칩니다. 50마이크로리터의 마그네틱 비드를 튜브 A와 피펫에 3회 이상 추가하여 비드를 완전히 혼합합니다. 즉시 튜브 A를 자석 스탠드에 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
그런 다음 농축된 세포 현탁액을 튜브 B에 조심스럽게 피펫팅하여 최적의 PBMC 회수를 위해 적혈구가 없거나 최소한의 투명한 분획을 수집합니다. 그 후, 마그넷 스탠드에서 튜브 A를 제거하고 폐기하십시오. 다음으로, 50마이크로리터의 마그네틱 비드를 튜브 B의 셀 현탁액에 추가하고 피펫팅을 위아래로 3회 이상 수행합니다.
즉시 튜브 B를 자석 스탠드에 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 농축된 세포 현탁액을 튜브 C에 조심스럽게 피펫팅하여 투명한 분획만 수집합니다. 자석 스탠드에서 튜브 B를 제거하고 폐기하십시오.
그런 다음 즉시 튜브 C를 자석 스탠드에 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 농축된 세포 현탁액을 라벨이 부착된 원심분리 튜브에 조심스럽게 피펫팅하고 PBS를 최대 2ml까지 보충합니다. 50 마이크로리터의 세포 현탁액을 자동 세포 카운터의 샘플 컵으로 옮깁니다.
1-10 희석 세포 수를 위해 450 마이크로리터의 PBS를 추가합니다.
