시작하려면 마취된 마우스를 입체 장치에 놓습니다. 수술용 가위로 두피의 정중선을 따라 연속적으로 절개하고 두피의 일부를 잘라내어 두개골 표면이 노출되도록 합니다. 마이크로 드릴로 지정된 부위에 개두술을 만들고 4 점을 경계로 설정합니다.
뇌 조직이 보이면 시추를 중단하십시오. 제어판을 사용하여 80나노리터의 바이러스를 주입하도록 주입기를 설정합니다. 제어판의 Inject 버튼을 클릭하여 초당 1나노리터의 유속으로 치상이랑에 바이러스를 주입합니다.
뇌 조직을 흡입하려면 뭉툭한 바늘 끝을 뇌 조직 위로 바짝 돌리고 부드럽게 눌러 흡인을 용이하게 합니다. 뇌를 명확하게 볼 수 있도록 흡입하는 동안 차가운 식염수로 계속 헹굽니다. 흡인의 깊이를 모니터링하기 위해 조직의 특징을 면밀히 관찰하십시오.
피질 조직은 옅은 분홍색입니다. 아래의 뇌량은 백색 섬유 조직으로 나타납니다. 그리고 해마 CA1 층은 짙은 빨간색과 회색입니다.
조직의 표면이 매끄러워지고 CA1의 넓은 영역이 노출되면 흡입을 중지하십시오. 그린 렌즈에 부착된 홀더를 뚫린 구멍 위로 이동합니다. grin lens가 뇌 조직의 표면에 닿으면 Z축을 0으로 설정합니다.
등쪽 복부 축에서 1.32mm를 뺀 구멍에 미소 렌즈를 삽입합니다. 홀더를 5-10분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 홀더를 올리고 식염수로 구멍을 헹굽니다.
바늘을 사용하여 미소 렌즈 주위에 자외선 수지를 바릅니다. 수지가 고체가 되도록 15초 동안 자외선으로 해당 부위를 비춥니다. 미소 렌즈에서 홀더를 조심스럽게 제거합니다.
노출된 두개골 전체를 자외선 수지로 덮습니다. 두개골의 헤드 플레이트를 적절한 위치에 놓습니다. 두개골 전체와 머리 플레이트를 15초 동안 자외선으로 비춥니다.
노출된 미소 렌즈를 3D 프린팅 보호 캡으로 덮습니다. M1.6 나사를 사용하여 캡을 헤드 플레이트에 고정합니다. Miniscope 제어 소프트웨어를 켜고 구성 파일 선택을 클릭합니다.
그런 다음 vscode를 선택한 다음 사용자 구성 파일을 선택합니다. 이제 실행을 클릭합니다. 그런 다음 LED 전원 버튼을 밀어 밝기를 조정합니다.
초점 조정 버튼을 밀어 값을 0에 가깝게 설정합니다. 베이스 플레이트를 미니 스코프에 부착하고 미니 스코프의 위치를 재조정하여 시야를 얻습니다.view 좋은 이미징 품질의 . 미니 스코프 베이스 플레이트 주위에 의치 베이스 재료의 첫 번째 층을 조심스럽게 적용합니다.
시멘트의 첫 번째 층이 굳어지면 베이스 플레이트에서 헤드 플레이트까지 두 번째 시멘트 층을 적용합니다. 모든 의치 모재가 굳은 후 고정 나사를 풀고 베이스 플레이트에서 미니 스코프를 분리합니다. 베이스 플레이트 캡을 베이스 플레이트에 넣어 노출된 미소 렌즈를 보호하고 고정 나사를 조입니다.
이미징 후 이미징 데이터를 AVI에서 HDF5 형식으로 변환합니다. 비강성 모션 교정을 적용하고 모션 교정된 동영상을 다운샘플링합니다. 다운샘플링 데이터에 추출물을 적용하여 단일 세포 신호를 식별합니다.
그런 다음 셀 검사를 적용하고 잠재적인 셀을 수동으로 선택합니다. 셀 확인 창을 닫기 전에 데이터 저장을 클릭합니다. 마지막으로 데이터 파일을 저장합니다.
실패한 in vivo 칼슘 이미징에서는 이미징 시야에서 활성 세포가 관찰되지 않았습니다. 성공적인 in vivo 칼슘 이미징은 뚜렷한 혈관이 없는 10개 미만의 활성 세포를 보여주었습니다. 눈에 보이는 혈관이 있는 50개 이상의 활성 세포.
그리고 깨끗한 혈관을 가진 수백 개의 활성 세포. 성공적인 in vivo 칼슘 이미징 기록에서 추출된 개별 세포는 대표적인 칼슘 흔적이 표시된 시야에 중첩되었습니다. GCaMP6F 발현의 위치와 그린 렌즈의 궤적을 마우스의 뇌 절편에서 검증하였다.
