먼저 운명 특이적 뇌 오가노이드를 사용하여 바이러스 표지된 아셈블로이드를 생성합니다. MEA 표면 전처리를 위한 시약을 준비하려면 0.5g의 세제 효소 분말을 탈이온수 50ml에 용해시킵니다. 분말이 완전히 용해될 때까지 혼합물을 철저히 소용돌이치고 생물 안전 캐비닛 내부의 멸균 튜브 상단 진공 필터를 사용하여 용액을 멸균합니다.
500 % 폴리에틸렌 민 또는 PEI 원액 7 마이크로 리터를 49.5 밀리리터의 1X 붕산염 완충액으로 희석하여 0.07 % PEI 용액을 제조합니다. 용액을 멸균하려면 생물 안전 캐비닛 내부의 0.22마이크로미터 필터 장치를 통해 여과합니다. 다음으로, 1% 세제 효소 용액 1mL를 멸균 MEA 플레이트의 각 웰에 분배하고 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.
그런 다음 각 웰에서 세제 효소 용액을 제거하고 웰당 1.5ml의 멸균 탈이온수로 웰을 5회 세척합니다. 사전 컨디셔닝을 위해 각 웰에 1mL의 배양 배지를 채웁니다. MEA 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 인큐베이터에 이틀 동안 다시 넣습니다.
배양 후 웰에서 배양 배지를 제거하고 50마이크로리터의 0.07%PEI 용액을 추가하여 1차 코팅용 MEA 전극을 덮습니다. 접시를 섭씨 37도에서 한 시간 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에서 PEI 용액을 완전히 흡인합니다.
멸균 탈이온수 1ml로 각 우물을 세 번 세척합니다. 물을 흡입한 후 뚜껑을 연 상태로 생물 안전 캐비닛에서 플레이트를 실온에서 15분 동안 건조시킵니다. 이제 각 웰의 전극 영역을 2차 코팅을 위해 배양 배지에 희석된 1 내지 20 부피의 기저막 매트릭스 50 마이크로리터로 덮습니다.
MEA 플레이트를 밤새 섭씨 37도 인큐베이터에 다시 넣습니다. 다음 날, 희석된 매트릭스 용액을 흡인하여 표면에 얇은 층을 남깁니다. 두꺼운 층이 형성되면 P1000 피펫 팁을 사용하여 전극 접촉 부위에 배양 배지를 강하게 분사합니다.
그런 다음 와이드 컷이 있는 P1000 팁을 사용하여 접시에서 어셈블리를 수집하고 가능한 한 적은 매체를 전송하면서 우물의 전극 위에 조심스럽게 놓습니다. 플레이트를 층류 후드의 해부 현미경 아래에 놓고 멸균 P 20 팁을 사용하여 조립체를 원하는 위치로 조심스럽게 밀어 넣습니다. P 20 팁을 사용하여 어셈블로이드 주변의 과도한 액체를 제거합니다.
배양 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 그런 다음 해부 현미경으로 관찰하고 배양 배지에 희석된 1-50 기저막 매트릭스의 작은 방울 2-3방울을 조립체 위에 바르고 플레이트를 인큐베이터로 30분 더 되돌립니다. 그런 다음 해부 현미경을 사용하여 배양 배지 3방울을 assembloids 가까이에 조심스럽게 추가합니다.
다음 날, 해부 현미경으로 assembloids가 정착되고 안정화되었는지 확인하십시오. 750마이크로리터의 배양 배지를 추가하여 총 부피를 웰당 1밀리리터로 만들고 인큐베이터에서 최소 2일 동안 플레이트를 방해하지 않고 그대로 둡니다. 매주 각 웰에서 500마이크로리터의 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 각 웰에 새로운 700마이크로리터의 신경 생리학적 기저 배지를 도입합니다.
78일째에 비해 92일째에 네트워크 파열 지속 시간이 증가된 것이 관찰되었는데, 이는 뉴런 성숙 때문일 수 있습니다. 셀룰러와 네트워크 활동은 125일째에 서서히 사라졌다.
