이 프로토콜은 멀티플렉스 면역 형광 프로토콜의 개발 최적화 및 전송이 복잡하고 어렵기 때문에 중요합니다. 많은 실험실에서 최적화된 프로토콜의 발가락 보유는 매우 중요합니다. 다중 스펙트럼 면역 형광은 종양 안팎의 다중 세포 유형의 위치와 정체성을 모두 평가할 수 있게 합니다.
이것은 면역 종양학 연구 결과에 있는 정보의 강력한 조합입니다. 멀티플렉스 면역 형광에 가장 강력한 사용은 면역 종양학입니다. 그러나 setu에서 다중 면역 세포 모형을 조사하는 기능은 모든 자가 면역 및 선동적인 치료에 걸쳐 이용될 수 있습니다.
고체 세포 안팎의 면역 세포의 위치와 표현형을 아는 것은 종양 특정 면역 요법에 대한 예후 및 예측 가능한 반응입니다. 프로토콜의 최적화 및 유효성 검사는 서두르지 않아야 하는 주요 단계입니다. 새로운 개발자는 다중 스펙트럼 이미징과 관련된 새로운 종류의 아티팩트에 익숙해져야 합니다.
기본 멀티 플렉스 프로토콜을 찾으려면 자동화된 스테인에 미리 로드됩니다. 프로토콜 화면에서 선호하는 대신 모두를 필터링합니다. 변경하기 전에 원래 프로토콜을 저장하고 프로토콜 탭을 클릭하고 오른쪽 을 클릭하여 오팔 6 멀티플렉스를 클릭하여 복사본을 선택합니다.
새 창에서 이름을 7멀티플렉스 프로토콜 1'으로 변경하고 올바른 장치와 연결된 탭을 선택합니다. 보충 표 S1'에서 프로토콜을 일치시키고 시약을 추가클릭하면 시약으로 peroxidase 억제제를 선택하여 10분 파록시제 억제 단계를 추가합니다. 차단 단계는 단백질 키나아제 차단 버퍼를 이용하고, 각 1차 항체가 적절한 시약을 지칭하며, 이차 항체 단계는 고추냉이 과산화고분자를 이용하며 다중 스펙트럼 자동화 키트와 함께 제공되는 스펙트럼 다이를 활용한다는 것을 확인한다.
프로토콜이 peroxidase 억제제를 포함하고 있는지 확인하고, 단백질 차단 단계, 1 차 적인 항체, 이차 항체, 티라미드 바닥 및 항원 검색을 포함하는 6개의 순차적 염색 실행이 각각 항체를 제거하는지 확인하십시오. 드롭 컨트롤을 추가하려면 7 멀티플렉스 프로토콜 1'이름을 복사하고 7 멀티플렉스 프로토콜 1 CD68 드롭으로 변경합니다. CD68 항체 시약을 마우스 IgG로 변경하고 프로토콜을 저장합니다.
그런 다음 각 드롭 컨트롤에 대해 하나씩 6개의 새 프로토콜을 만들고 동일한 방식으로 완전한 iso 형 컨트롤을 만듭니다. 여기에 표시된 것과 동일한 방식으로 각 대상에 대한 드롭 제어 프로토콜을 만듭니다. 연구 감지 키트를 준비하려면 1X 트리스 버퍼식 식염수로 표시된 30 밀리리터 오픈 컨테이너를 채우고 멀티플렉스 연구 키트 1의 핸들에서 가장 멀리 떨어진 위치에 컨테이너를 배치합니다.
2개의 30 밀리리터 오픈 컨테이너 muli-spectral 블록및 다중 스펙트럼 블록에 라벨을 붙이고, 다중 스펙트럼 염색 키트에서 완충 항체 희석제30 밀리리터로 뮤틀리 스펙트럼 블록 용기를 채웁니다. 다중 스펙트럼 이차 용기에 다중 스펙트럼 이차 용기에 다중 스펙트럼 염색 키트에서 안티 마우스 안티 라비드 이차 항체 폴리머 30 밀리리터를 채우고 10 7 밀리리터 오픈 용기각각에 600 마이크로리터의 항체 희석제를 첨가한다. 다음으로, 테이블에 표시된 부피의 적절한 튜브에 농축 된 1 차 항체를 추가하고 부드러운 파이펫팅으로 혼합합니다.
이중 증류수 3밀리리터, 12방울의 스펙트럼 다피 한 개와 7밀리리터 오픈 용기에 12방울, 퍼록시다제 블록 3밀리리터를 2차 7밀리리터 오픈 컨테이너에 넣습니다. 디메틸 설옥화물 75 마이크로리터로 각 리아탈화 바닥을 다시 중단하고 파이펫팅으로 섞습니다. 그런 다음 티라미드 신호 증폭 바닥 재고를 준비될 때까지 섭씨 4도에 저장합니다.
개별 TSA 바닥 희석을 준비하는 동안. 자동 스테인에 모든 시약을 등록한 다음 각 용기를 시약 랙에 넣고 모든 시약을 자동화된 스테너에 로드합니다. 얼룩은 존재를 감지하고 각 시약의 부피를 확인합니다.
모든 시약이 로드되면 프로토콜을 활성화하여 밤새 실행합니다. 염색 절차가 끝나면 커버 슬립으로 샘플을 장착하고 샘플을 다중 스펙트럼 이미징 플랫폼 스캐너에 적재하여 스캔합니다. 모든 샘플을 스캔하면 이미지가 qptiff 파일로 포맷됩니다.
적절한 qptiff 분석 소프트웨어 프로그램을 열고 로드 슬라이드를 클릭하여 관심 슬라이드의 5개의 필터 전체 슬라이드 스캔을 엽니다. 로그인하여 스탬프 도구를 사용하여 다중 스펙트럼 이미징을 위해 5개의 영역을 선택합니다. 아래 선택: 필즈의 언더 사이즈 선택: 1x1 을 선택하고 필드 해상도에서 0.5 마이크로미터 20x를 선택합니다.
이 사이토케라틴 염색에 기초하여 사이토케라틴 양성 종양 조직, 및 세포케라틴 음성 기질 조직을 모두 가진 몇몇 영역을 선택하여 전반적인 스캔에서 심영상될 수 있다. 모든 다중 스펙트럼 이미지를 선택한 경우 Vectra 소프트웨어로 전환하여 각 슬라이드에 대해 검사에서 다중 스펙트럼 이미징'으로 작업을 변경합니다. 그런 다음 검사를 클릭하여 다중 스펙트럼 이미징 컬렉션을 수행합니다.
다중 스펙트럼 이미지 수집이 완료되면 스펙트럼 언믹싱 소프트웨어를 사용하여 다중 스펙트럼 이미지 폴더 내에서 파일을 엽니다. 이미지 형식에서 다중 스펙트럼'언더 샘플 형식'을 선택합니다'그리고 스펙트럼 라이브러리 소스에서 '선택'inForm'바닥을 선택하고 6 층 을 모두 로드하고 샘플 라이브러리 슬라이드에서 다피를 클릭하고 모든 준비를 클릭합니다. 스펙트럼 언 믹싱 소프트웨어는 제공된 스펙트럼 프로파일을 사용하여 모든 열린 이미지에서 스펙트럼 언믹싱을 수행합니다.
자동 형광 스펙트럼 프로파일을 식별하고 주석을 지정합니다. 자동 형광 기능을 확인하여 혼합 해제 후 자동 형광 채널에서 완전히 캡처되었는지 확인하고 다른 샘플링이 허용있게 제거될 때까지 테스트해야 합니다. 그런 다음 병리학자와 동일한 조직의 순차적 슬라이드에서 동일한 표적의 염색체 단일 얼룩에 대한 염색 패턴을 평가합니다.
각 채널의 형광 강도를 평가하려면 카운트 도구를 사용하여 열린 이미지를 조사합니다. 그런 다음 염색 프로토콜로 돌아가서 TSA 농도를 조정하여 허용 범위를 초과하거나 도달하지 못하는 정규화된 수를 해결합니다. 이러한 대표적인 분석에서 편도선 조직은 토실 표면 내에서 명확하게 정의된 사이토케라틴 염색을 시연했으며, 시토케라틴과 PDL-1이 토굴의 망막상에서 명백한 침구를 가진 림프구 조직의 배경이 없는 편평상피상피를 입증했다.
여포 발아 센터는 Ki-67 양성 림프구에서 쉽게 인식할 수 있고 풍부했습니다. 발아 센터 내에 존재하는 대식세포는 발아 센터 외부에서도 관찰된 일부 대식세포와 함께 CD-68 발현에 의해 확인되었다. CD-8 염색 림프구는 T 세포 분포와 PD-1 발현을 강하게 염색된 작은 림프구가 발아 센터의 주변에 모여, 뿐만 아니라 간 간 부위에 흩어져 있다.
예상되는 염색 패턴이 편도선 조직 조절에서 확인된 후, 폐암 샘플에서 동일한 염색을 평가할 수 있었다. 동종형 네거티브 컨트롤 및 드롭 컨트롤도 평가되어야 합니다.배경 및 자동 형광검출뿐만 아니라 우산 효과 및 스펙트럼 출혈도 평가되어야 합니다. 드롭 컨트롤은 새로운 멀티 플렉스 패널의 최적화 중에 다발성 면역 불발성 방법으로 인해 염색에 있는 잠재적인 아티팩트를 평가하는 데 중요합니다.
각 낙하 제어는 각 특정 대조군에서 제거되어야 하는 단일 1차 항체를 제외하고 전체 멀티 플렉스 패널과 동일한 염색 패턴을 보여줘야 한다. 다중 스펙트럼 면역 형광을 가진 면역 프로파일링은 면역 기준에 의하여 종양과 지구의 계층화를 허용하고 그 때 대규모 멀티플렉스 게놈, 전사, 및 proteomic 연구 결과에 의해 조사될 수 있습니다. 나는 setu의 한 섹션에서 면역 및 병원성 세포의 식별 및 특성화를 허용하는 종양학 및 자가 면역 장애에서 작용 메커니즘을 조사하기 위해 다중 플렉스 면역 fluorescence를 사용했습니다.
일반적인 예방 조치는 인체 단백질, 티라미드 및 다피에 대한 항체와 함께 작업 할 때 취해야하지만,이 프로토콜의 시약이나 물질은 특히 위험한 것으로 알려져 있습니다.
