DIC 현미경 검사는 복잡한 환경에서 이미징 플라스모닉 나노 입자의 암장보다 우수합니다. 그러나 DIC는 재현 가능한 결과를 얻기 위해 더 큰 지식과 기술이 필요합니다. DIC 현미경 검사는 높은 측면 해상도와 얕은 필드 깊이를 모두 제공합니다.
이 두 특성은 세포 내 또는 복잡한 환경에서 나노 입자를 모니터링 할 때 매우 중요합니다. 먼저 스크리빙 펜을 사용하여 각 유리 커버슬립의 중앙에 얕고 짧은 스크래치 표시를 배치한 다음 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유리를 청소합니다. 다음으로 마이크로파이프를 사용하여 원래 저장 용기에서 밀리리터 당 05밀리그램 골드 나노 입자 용액의 100 마이크로리터를 제거하고 용액을 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 배출합니다.
시료를 6, 000배에서 10분 동안 원심분리합니다. 완료되면, 나노 입자 용액에서 과도한 계면활성제를 제거하기 위해 마이크로 파이펫으로 상체를 제거합니다. 다음으로 원심분리기 튜브에 100마이크로리터의 초순수수를 추가합니다.
샘플을 잠시 소용돌이쳐 펠릿을 분해한 다음 즉시 20분 동안 초음파 처리하여 나노입자 응고를 완전히 재보페합니다. 마이크로파이프를 사용하여 나노 입자 용액 6 마이크로리터를 세척 및 긁힌 유리 커버슬립에 떨어뜨립니다. 그런 다음 조심스럽게 커버 슬립을 뒤집어 현미경 유리의 두 번째 큰 조각 위에 배치합니다.
드롭은 유리의 두 조각 사이에 균등하게 확산해야합니다. 유리의 두 조각 사이에 갇혀 기포를 피하기 위해주의하십시오. 좁은 매니큐어 라인을 사용하여 커버슬립의 가장자리를 밀봉하여 액체의 증발을 방지합니다.
현미경 단계에 샘플을 배치하고 현미경의 목표와 응축기를 정렬합니다. 초점을 조정하여 샘플로 초점 평면을 찾고 이전에 만든 스크래치 마크를 찾습니다. 나노 입자가 볼 때까지 초점을 집중하고 초점을 미세 조정합니다.
응축기의 정확한 배치를 결정하기 위해 20배 의 목표에서 시작하여 80배 또는 100x와 같은 높은 배율로 이동하여 Kohler 조명 방법을 활용하십시오. 다음으로, 이미징을 위한 샘플 내에서 관심 영역을 선택합니다. 카메라 의 시야에서 영역을 중앙 집중하고 필요에 따라 초점을 조정합니다.
현미경이 드 세나르몬트 설계를 가지고 있다면, 최대 배경 멸종에 가까운 편광제로 시작하고 점차적으로 배경 멸종을 감소향해 편광기를 회전. 배경 강도가 점차 증가합니다. 이상적인 설정은 나노 입자가 로컬 배경 평균에 비해 가장 큰 강도 차이에 도달 할 때 달성된다.
플라스모닉 나노 입자의 경우, 가장 큰 대조는 일반적으로 최대 배경 소멸또는 그 근처에서 비교적 어두운 배경으로 달성된다. 길 잃은 조명이 프로세스와 상호 작용하지 않도록 실내 조명을 끕니다. 관심 영역을 보기 위해 중앙 파장이 주요 국부화 표면 플라스몬 공명 파장과 공동 으로 위치한 반최대 반최대 대역 패스 필터에서 10 나노미터 의 전체 폭을 배치합니다.
다음으로, 배경 수준이 카메라최대 용량 레벨의 5%~40%에 달할 때까지 램프 강도 또는 노출 시간을 조정합니다. 관심 영역 내의 어떤 물체도 카메라 최대 강도 레벨의 90%를 초과하는 신호 강도를 나타내야 합니다. 각각 10 나노미터의 절반 최대에서 전체 폭을 가지고 있는 일련의 밴드 패스 필터로 샘플을 이미지화하여 전체적으로 전체 파장 범위에 걸쳐 이미징을 가능하게 합니다.
램프 전원이 아닌 노출 시간을 조정하여 이미지의 배경 강도가 서로의 5% 이내로 유지되도록 합니다. 필터를 전환한 후 이미지를 캡처하기 전에 샘플을 다시 초점을 맞춥니다. 모든 관련 정보를 보존하기 위해 이미지를 압축되지 않은 TIFF 파일 및/또는 소프트웨어의 기본 파일 형식으로 저장합니다.
분석을 시작하려면 ImageJ로 이미지를 엽니다. 직사각형 도구를 사용하여 관심 있는 주요 영역 주위에 사각형을 그립니다. 그런 다음 도구 모음에서 이미지를 선택하고 확대/축소로 이동하여 선택하도록 선택합니다.
이미징 창은 선택한 영역을 확대합니다. 다음으로 이미지를 선택하고 조정하고 밝기/대비를 선택합니다. 샘플 영역의 뷰를 개선하려면 이미지의 최소, 최대, 밝기 및 대비를 조정합니다.
이러한 조정은 과학적 데이터를 변경하지 않으며 샘플 영역의 더 나은 가시성을 가능하게합니다. 이제 사각형 도구를 다시 사용하고 측정할 첫 번째 나노 입자 주위에 상자를 그립니다. 상자는 나노 입자의 통풍 디스크보다 약간 커야합니다.
일단 선택되면 분석하여 측정값을 선택합니다. 선택한 상자 안에 있는 픽셀에 대한 최소, 최대 및 평균 강도를 보고하는 새 창이 나타납니다. 상자의 원래 크기를 유지하 되 고, 배경 대비가 상대적으로 균등한 입자에 바로 인접한 영역으로 상자를 드래그하고, 입자 나 오염 물질이 존재하지 않습니다.
측정 도구를 다시 사용하여 백그라운드 영역의 평균 강도를 결정합니다. 계열의 모든 이미지에서 각 파티클에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 그런 다음 데이터를 스프레드시트로 내보내 모든 파장 및 각도에서 각 파티클의 대비 또는 강도를 계산합니다.
다음 방정식을 입력하여 각 파티클의 대비를 계산합니다. 마지막으로 X축을 따라 파장을 사용하여 데이터를 플로팅하고 Y축을 따라 콘트라스트 또는 강도를 플로팅하여 지정된 나노입자 위치에서 스펙트럼 프로파일을 그래프로 지정합니다. 최적의 이미징 설정을 결정하기 위해 이러한 금 나노스피어는 여러 편광제 설정에서 이미지화되었습니다.
0도에서 파티클은 주로 흰색으로 표시되고 중간 부를 가로질러 어두운 줄무늬가 실행됩니다. 이는 나노스피어 샘플에 대한 교차 편광을 나타냅니다. 편광자가 서로 다른 각도로 회전하면 파티클이 어두운 그림자를 한 쪽 모서리쪽으로 투사합니다.
그러나 파티클 대비 값은 크게 변경됩니다. 이 샘플의 경우 최적의 이미징 설정은 편광기 시동이 10도입니다. 여기서 파장이 금 나노구의 대비에 대해 플롯됩니다.
각 데이터 포인트는 각 입자 직경에 대해 평균 20 나노스피어를 나타냅니다. 각 파티클의 피크 콘트라스트는 크기에 따라 약간 이동합니다. 강도와 회전은 이 금 나노로드와 같은 이중성 모양으로 더욱 중요합니다.
여기서 파장이 두 개의 서로 다른 편광제 설정에서 강도에 대해 플롯됩니다. 각각의 경우, 밝은 면의 강도는 어두운 면보다 훨씬 강하다. 스테이지 회전 시 국소화된 표면 플라스몬 공명 파장에서 단일 금 나노로드의 강도 프로파일은 샘플이 180도를 통해 회전할 때 어둡고 밝은 면 사이의 큰 강도 차이를 나타낸다.
샘플 이미징은 매우 중요합니다. 그것은 현미경의 부분에 부지런함과 인내심을 모두 필요로한다. 일련의 일 동안 샘플을 다시 이미징해야 하는 실험을 수행하는 경우 스크래치 마크와 같은 랜드마크가 관심 영역을 이전하는 데 중요합니다.
DIC 현미경 검사는 나노 입자를 연구하는 연구원에 의해 관심에서 성장하고있다, 특히 동적 및 세포 환경에서. DIC는 특히 복잡한 샘플링 환경에서 최적의 공간 해상도를 제공합니다.
