우리의 프로토콜은 우리가 바이오 분포를 추적하고 두 개의 분리되었지만 보완적인 방법론을 사용하여 관심의 펩타이드의 조직 별 내재화를 확인할 수 있게 합니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여 단일 동물에서 얻은 데이터를 최대화하고 정량적 축형 형광 이미징 데이터를 수집할 수 있습니다. 또한, 우리는 질적 현미경 이미지를 얻을 수 있습니다.
펩타이드 합성 시설에서 Cy5.5로 표시된 N-terminus 와 고체 위상 합성 C-terminus amide cap CTP를 획득한 후, 빛으로부터 영하 80도의 저장을 위해 디메틸 설프리산화물CTP의 1개 또는 10 밀리몰러 스톡 액액알리트를 만듭니다. 실험 당일, 인슐린 주사기에 PBS의 200 마이크로 리터에 Cy5.5 CTP의 킬로그램 복용량 당 10 밀리그램을로드합니다. 마우스의 무게와 정맥 내 6 주 된 여성 CD1 마우스에 펩티드를 전달합니다.
펩타이드는 고류 CO2 챔버를 사용하여 마우스를 안락사시키고 가위를 사용하여 가슴 구멍을 열고 오른쪽 아트리움의 측면 자유 벽에 작은 닉을 만들기 전에 미리 지정된 실험 기간 동안 순환할 수 있도록 합니다. 26 게이지 바늘을 장착 한 5 밀리리터 주사기를 사용하여 왼쪽 심실 정점을 통해 10 % 완충 된 포르민 인산염 3 밀리리터를 견딜 수 있어 조직을 고치고 적혈구를 씻어 내보도록하십시오. 그런 다음 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 크고 작은 내장, 방광, 난소 또는 고환, 그리고 뇌를 전 생체 광학 이미징을 위한 12웰 플레이트의 개별 우물로 수집합니다.
CTP 변환 된 이미지의 생체 내 이미징의 경우 이미지 수집 소프트웨어를 시작하고 초기화를 클릭하여 이미징을 위한 시스템을 준비하십시오. 이미징 마법사를 열고 형광 및 필터 쌍을 선택합니다. 이름, 염료, 시안화물 및 Cy5를 클릭하여 여기 및 방출 매개 변수를 설정합니다.
수동 설정을 클릭하여 1초에 대한 노출, 작은 비닝, F/Stop을 8으로 설정하고 시야를 15cm로 설정합니다. 샘플을 저장하기 위해 폴더를 획득하고 설정합니다. 편집 이미지 레이블 창에 적절한 실험 정보를 추가하고 확인을 클릭합니다. 획득한 이미지가 나타납니다.
단위를 복사 효율로 설정합니다. 이미지를 두 번 클릭하고 수정 및 어댑티브 형광 배경 뺄셈을 클릭합니다. 임계값을 조정하여 관심 있는 장기만 덮습니다.
또는 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 자르기 영역을 선택하여 관심 있는 모든 샘플이 포함된 상자를 그립니다. 모든 이미지가 획득되면, 시료를 10% 버퍼링한 포르말린 인산염을 함유한 신경병 으로 옮기고, 조직의 20배 이상의 부피로 샘플을 옮기고, 적어도 48시간 동안 빛으로부터 보호된 실온에서 조직을 저장한다. 이미지를 정량화하려면 단위를 복사 효율로 설정하고 관심 영역을 4x 3으로 설정합니다.
관심 상자의 영역을 조정하여 모든 우물을 균일하게 커버하고 관심 영역 측정을 클릭합니다. 그런 다음 관심 영역의 셀과 일치하도록 관심 영역 그리드 리전을 클릭하고 내보내기를 클릭하여 텍스트 또는 CSV 파일에 데이터를 저장합니다. 장기가 최소 48시간 후에 충분히 고정되면 샘플을 조직 처리 및 캐세트 포함으로 옮기고 카세트를 조직 처리 기계에 적재합니다.
표시된 대로 에탄올로 조직을 탈수하는 프로세서를 설정한 다음 30 분 자일렌 트리트먼트 2 개와 파라핀 주입 4 개를 30 분 파라핀 트리트먼트로 청소하십시오. 마지막 파라핀 처리 후, 처리 기계에서 조직을 제거합니다. 개별 금속 금형에 조직을 놓고 용융 파라핀으로 각 금형을 정렬합니다.
금형을 콜드 플레이트에 놓습니다. 곰팡이 바닥의 파라핀이 고화되기 시작하면 장기를 파라핀에 넣습니다. 모든 장기가 배치되면 라벨이 부착된 카세트를 금형 위에 백업으로 놓고 몰드를 용융 파라핀으로 덮어 놓습니다.
파라핀이 밤새 영하 20도의 블록을 저장하기 전에 단단한 때까지 식힙니다. 다음 날 아침, 6도의 블레이드 각도와 10 마이크로 미터의 단면 두께로 마이크로 토메를 설정하고 마이크로 톤에 조직 블록을 장착합니다. 조직을 포함하는 단면도가 얻어질 때까지 절단을 시작하고 5 분 동안 또는 조직이 몇몇 수분을 흡수할 때까지 38도 증류수 욕조에 아래로 블록을 놓습니다.
조직의 얇은 흰색 윤곽선이 블록에 나타나면 조직을 평평한 얼음 블록에 10 분 동안 놓은 후 방금 로드 된 것과 동일한 방향으로 마이크로 토메로 되돌보십시오. 잘린 섹션이 각각 6~10개의 섹션의 긴 리본을 형성할 수 있도록 조각을 얻기 시작합니다. 성공적인 조직 섹션 획득을 보장하기 위해 블록을 수분을 유지합니다.
단면 품질이 좋지 않거나 감소하기 시작하면 블록을 얼음으로 되돌려 보입니다. 슬라이드를 덮을 수 있는 충분한 길이의 고품질 리본이 생성될 때까지 최적이 아닌 파라핀 리본을 폐기하십시오. 무딘 가장자리를 사용하여 양질의 리본을 섭씨 38도의 수조로 옮기고 단면도가 부드러워질 때까지 증류수 표면에 놓이도록 하십시오.
평평한 부분을 깨끗한 유리 슬라이드 표면에 띄우고 왁스를 섭씨 65도 오븐에서 30분 동안 녹입니다. 슬라이드를 분리하려면 시료를 자일렌으로 3회 치료하여 치료당 10분 동안 처리합니다. 마지막 자일렌 치료 후, 표시된 대로 5 분 내림차순 에탄올 몰입으로 조직을 수분하고, 트리스 버퍼링 식염수에 5 분 침수.
슬라이드가 하룻밤 동안 건조할 수 있도록 허용한 후, DAPI로 보충된 커버립과 125마이크로리터의 마운트 매체를 장착하고 형광 현미경 으로 이미징하기 전에 밤새 빛으로부터 보호된 슬라이드를 건조시다. 고정 후, 실험 및 제어 동물의 심장, 폐, 간, 신장, 비장 및 뇌는 전 생체 광학 형광 이미징을위한 12 웰 플레이트에 배치됩니다. 카운트를 복사 효율로 변환하면 각 장기 집합에 대해 형광 데이터를 정량화할 수 있습니다.
다른 장기는 다른 흥분 파장에 대한 응답으로 자동 형광을 입증한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 향상된 녹색 형광 단백질과 같은 짧은 흥분 파장은 특히 간 및 뇌에서 원적외선 또는 근적외선 흥분 파장보다 더 높은 수준의 자동 형광과 관련이 있습니다. 각 기관에서 조직 섹션의 포르말린 고정 및 파라핀 포함은 관심있는 세포 마커의 면역 플루오로화학 분석뿐만 아니라 각 조직 내에서 관심있는 면역 또는 기질 세포의 정량화를 허용합니다.
채도를 방지하고 설정을 추적하기 위해 이미징 설정을 조정한 다음 일관성과 정확성을 위해 동일한 실험에서 동일한 수집 설정을 다른 샘플에 적용합니다. 면역조직화학은 또한 조직 단면도에서 수행될 수 있다, 후보세포 관통 펩타이드가 관심있는 구조 또는 단백질과 공동 국소화되는 경우.
