이 프로토콜은 예를 들어, 곤충 저항 및 말라리아 기생충 발달을 포함하여 다양한 생리적 경로에 관여하는 모기 유전자의 역할의 특성화를 지원합니다. 이 방법은 전형형게소로 트랜스진 삽입을 유도하여 대체 트랜스게놈으로 인한 표현형을 직접 비교할 수 있어 위치 효과 문제를 효과적으로 피할 수 있다. 이 방법은 공중 보건및 농업중요성의 다양한 곤충 종에 적용될 수 있고 그 응용은 박테리아에서 포유류 세포로 넓게 확장된다.
지배적 인 형광 마커, attB 재조합 사이트 및 원하는 유전자화물을 운반하는 attB 기증자 플라스미드를 설계하여 시작합니다. 카세트 교환을 위해 트랜스제닉 카세트 또는 두 개의 반전 된 attB 사이트를 운반하는 전체 플라스미드의 통합을 위해 단일 attB 사이트를 사용합니다. 내독소가 없는 정화 키트를 사용하여 기증자와 도우미 플라스미드를 정화합니다.
attB 태그 기증자 플라스미드는 관심의 트랜스진을 들고 및 헬머 플라스미드를 운반하는 데프러 플라스미드를 결합하여 기증자 플라스미드의 마이크로리터 당 350 나노그램과 도우미 플라스미드의 마이크로리터 당 150 나노그램의 최종 농도를 가진 혼합물을 얻습니다. 3개의 어금니 나트륨 아세테이트의 0.1 부피와 2.5권의 얼음 감기 100% 에탄올, 그 다음 소용돌이를 추가하여 DNA를 침전시합니다. 흰색 침전은 즉시 표시되어야 합니다.
펠릿을 세척하고 마이크로리터 당 500 나노그램의 총 최종 농도에 도달하기 위해 사출 버퍼에서 다시 중단하십시오. 그런 다음 각각 10-15 마이크로 리터의 알리쿼트를 준비하고 음의 섭씨 20도에 저장합니다. 혈액 은 원하는 도킹 라인에서 4 ~ 7 일 된 모기를 공급하고 그들의 야생 유형 대응 72 마이크로 주입 전에 시간.
45도 각도로 배아의 후방 극을 표적으로 하여 25 밀리머나트륨 염화나트륨에서 아노펠레 감비아아아 배아 마이크로 주사를 수행한다. 30도 각도로 후방 극을 대상으로 할로카본 오일에서 Anopheles stephensi 배아 마이크로 주사를 수행합니다. 주입 직후, 멸균 증류수로 채워진 페트리 접시에 계란을 옮기고 곤충 상태로 돌려보라고 한다.
부화시 G0 유충을 매일 소금에 절인 증류수가 있는 트레이에 옮기고 푸파에 넣습니다. 입체 권에서 섹스로 G0 강아지를 정렬합니다. 남성이 3~5개의 그룹으로 별도의 케이지에 등장하여 연령과 일치하는 야생 형 암컷의 10배 를 추가하도록 허용하십시오.
여성이 10에서 15의 그룹으로 별도의 케이지에 등장하고 연령일치 야생 유형 남성의 동일한 수를 추가 할 수 있습니다. 성인이 4~5일 동안 짝짓기를 하고 여성에게 혈액 식사를 제공하도록 허용합니다. 계란과 후면 신흥 차세대 G1을 수집합니다.
젖은 필터 종이가 늘어선 페트리 접시에 G1, L3 및 L4 애벌레를 수집하고 현미경 슬라이드에 부착된 마커의 존재를 위해 형광 스테레오스코프를 사용하여 이를 검사합니다. 단일 attB 디자인의 경우 새 마커와 기존 마커의 존재를 화면으로 표시합니다. 카세트 교환을 위한 이중 attB 설계의 경우, 새로운 마커의 존재와 기존 마커의 손실을 화면으로 설정합니다.
정렬 섹스에 의해 G1 pupae를 변환하고 이성 나이 일치 야생 유형 개인과 함께 한꺼번에 교차. 성인이 4~5일 동안 짝짓기를 하고 혈액 식사를 제공하도록 허용합니다. 단일 통합 실험의 경우, 한꺼번에 알을 직접 수집합니다.
카세트 교환 실험의 경우, 단일 여성으로부터 계란을 수집하고 두 개의 대체 카세트 방향의 잠재적 존재로 인해 분자 평가가 완료 될 때까지 자손분리를 유지합니다. 형광 마커의 존재를 위해 G2 자손을 스크린하고 분자 분석을 위한 G2 양성 개인의 하위 집합을 따로 둡니다. 나머지는 성인기에 리어트.
텍스트 원고에 설명된 대로 PCR을 사용하는 삽입 부위의 분자 유효성 검사를 수행합니다. 단일 통합의 경우, 예측 된 삽입 부위가 원래 도킹 구조와 두 하이브리드 사이트 attL 및 attR 사이에 기증자 플라스미드의 전체 시퀀스를 전달하도록 하십시오. 카세트 교환의 경우, 예측 삽입 사이트가 하이브리드 반전 attL 사이트가 원래 반전 된 attP 사이트를 대체하고 교환 템플릿이 그들 사이에 원래 존재하는 카세트를 대체하는 도킹 라인의 사이트와 동일한지 확인합니다.
프로토콜은 약 10주 안에 안정적인 Anopheles 형질 전환선을 생성하는 데 사용되었다. 3xP3 프로모터에 의해 조절된 형광 마커에 대한 스크리닝에 의해 수행된 변형의 Phenotypic 검증이 여기에 도시되었다. 새로운 Anopheles stephensi 라인은 DS 빨간색 표시 카세트를 CFP로 표시된 도킹 라인에 삽입하여 얻어졌으며, 그 결과 G1 자손은 눈에 빨간색과 파란색 형광으로 표시된 대로 두 마커를 모두 표현하는 결과를 낳았습니다.
카세트 교환 설계는 원래 도킹 라인에 삽입 된 마커의 교체를 기증자 플라스미드의 것과 결합합니다. 이 마커 교환은 CFP 마커가 분실되고 YFP 마커가 취득한 Anopheles 감비아도킹 라인에서 입증되었으며, YFP 마커는 노란 눈과 신경 코드 형광의 결과로 획득하였다. 때때로 RMCE는 애벌레가 원래 CFP와 새로운 YFP 마커로 표시된 원하는 형질 전환 카세트의 교환 대신 단일 통합 이벤트를 초래할 수 있습니다.
형광 마커의 존재를 검사 할 때, 가능한 배경 자동 형광과 신호를 구별하는 것이 중요합니다. 배율을 높이고 형광이 프로모터에 의해 구동 될 것으로 예상되는 조직과 장기에 초점을 맞추고 진정한 CFP 양성 개인을 식별할 필요가 있습니다. 개별 변압제는 또한 예상된 삽입 부위를 확인하기 위하여 PCR을 통해 분자적으로 평가되었습니다.
교환 Anopheles 감비아라인에서 개인에 대한 PCR 유효성 검사는 여기에 표시됩니다. 적절한 마이크로 주입 기술조차도 기증자와 도우미 플라스미드의 정확한 설계 및 준비뿐만 아니라 적절한 모기 축산 계획을 따르는 것이 형질 전환 개인을 얻는 데 핵심적입니다. 이 절차는 유전자 과잉 발현 또는 침묵을 일으키는 요소를 삽입하는 데 사용될 수있다, 예를 들어, GAL4/UAS 시스템, 뿐만 아니라 모기 유전 제어를위한 유전자 드라이브 요소 및 항 병원체 분자.
