조혈 동안, 조혈 줄기 세포는 글리코 분해에서 산화 인산화로 대사 전환을 겪습니다. 이 프로토콜은 마우스 조혈 줄기 및 전구 세포의 글리콜 및 미토콘드리아 기능을 평가하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 실시간으로 세포 생물 에너지를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
96웰 마이크로플레이트 기반 플랫폼은 고감도로 높은 처리량 정량화를 제공하므로 단일 플레이트를 사용하여 여러 샘플을 동시에 분석할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 조건에서 HSC 대사에 대한 화학 물질 또는 유전자 조작의 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. HSC 다능성을 유지하는 대사 경로를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.
현재의 연구는 주로 마우스 조혈 줄기 및 전구 세포에 초점을 맞추고 있지만, 프로토콜 및이 접근법은 모든 유형의 현탁액 세포에 대한 분석 조건을 최적화하기 위해 쉽게 적응 될 수 있습니다. 분석 하루 전, 세포외 플럭스 분석 키트를 열어 센서 카트리지 및 유틸리티 플레이트 어셈블리를 제거합니다. 다음날 사용할 수 있도록 로딩 가이드 플랫을 저장하십시오.
이제 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에서 수동으로 분리하고 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 플럭스 분석 키트에 포함된 200마이크로리터의 교정제로 유틸리티 플레이트의 각 웰을 채운 다음 센서 카트리지를 다시 유틸리티 플레이트에 올려 놓고 캘리브란트의 센서를 완전히 잠급니다. 그런 다음 교정제로 유틸리티 플레이트를 인큐베이션하고 원고에 언급 된 가습 조건에 따라 밤새 섭씨 37도의 비 이산화탄소 인큐베이터에서 센서 카트리지를 조립하십시오.
분석의 날에 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트 당 2.5 밀리리터의 세포 접착 용액을 준비한다. 플럭스 분석 키트에 포함된 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트를 열고 준비된 세포 접착 용액 25 마이크로리터를 각 웰의 바닥에 분주한다. 마이크로플레이트를 뚜껑으로 덮고 후드 내부의 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
배양 후, 다채널 피펫 또는 흡인기기를 사용하여 과량의 세포 접착 용액을 제거하고 버리고 200 마이크로리터의 멸균 초순수로 각 웰을 두 번 세척한다. 후드 내부의 뚜껑없이 플레이트를 30 ~ 45 분 동안 공기로 건조시킵니다. 제조된 마우스 계보 음성 HSPCs를 실온에서 5분 동안 200배 G에서 원심분리한다.
상청액을 폐기한 후, 세포 펠릿을 적절한 분석 배지에 재현탁시키고, 세포 현탁액을 다시 원심분리한다. 이 과정을 한 번 더 반복하고, 세포를 적절한 가온된 분석 배지에서 50 마이크로리터 당 250, 000 세포 또는 밀리리터 당 오백만 세포의 농도로 재현탁시킨다. 다채널 피펫을 사용하여 세포 접착제가 코팅된 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트의 각 웰의 측면을 따라 50 마이크로리터의 세포 현탁액을 첨가한 다음, 50 마이크로리터의 분석 배지를 코너 배경 측정 웰에 첨가한다.
코팅되지 않은 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트의 웰 당 50 마이크로리터의 물을 첨가하여 원심분리 밸런스 플레이트를 생성한다. 세포를 실온에서 1분 동안 200배 G에서 원심분리한다. 플레이트를 세포 부착을 위해 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 25 내지 30분 동안 인큐베이션한다.
30분 후, 현미경으로 세포가 마이크로플레이트 표면에 안정적으로 부착되어 있는지 육안으로 확인한다. 텍스트 원고에 언급된 바와 같이 미리 가온된 당분해 스트레스 시험 분석 배지에서 필요한 모든 용액을 준비함으로써 시작하고 수화된 센서 카트리지를 인큐베이터로부터 제거한다. 센서 카트리지를 교정기에서 들어올려 동일한 유틸리티 플레이트에 있는 교정기로 교체하여 기포를 제거합니다.
80개의 로딩 가이드를 센서 카트리지 상단에 평평하게 놓고 문자 A가 왼쪽 위 모서리에 위치하도록 방향을 지정합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 포트 A에 20 마이크로 리터의 100 밀리몰 포도당 용액을 분배하십시오.80 로딩 가이드 플랫을 BC 로딩 가이드 플랫으로 교체하고 문자 B를 왼쪽 상단 모서리에 맞 춥니 다. 22 마이크로리터의 20 마이크로몰 올리고마이신 용액을 포트 B.Reorient BC 로딩 가이드 플랫에 재배치하여 로딩 포트 C의 왼쪽 상단 모서리에 글자 C를 찾고 포트 C에 500 밀리몰 2-데옥시-d-글루코스 용액 25 마이크로리터를 분배한 다음 로딩 가이드 플랫을 제거하고 버립니다.
이제 컨트롤러에서 글리코 분해 스트레스 테스트를위한 템플릿을 만들거나 로드하십시오. 주사 전략, 치료 조건 및 세포 유형에 대한 세부 정보를 입력하고 그룹 생성을 누릅니다. 플레이트 맵으로 이동하여 분석할 각 그룹에 웰을 할당합니다.
프로토콜에서 초기화 단계에서 교정 및 평형화가 검사되었는지 확인하십시오. 각 주입 후 기준선 측정 및 측정의 경우 측정 주기 수를 세 개로 설정하고 혼합, 대기, 측정 시간을 세 분, 0분, 세 분으로 설정합니다. 소프트웨어에서 실행 시작을 클릭합니다.
적재되고 수화된 센서 카트리지에서 뚜껑을 꺼내 세포외 플럭스 분석기의 작업 트레이에 놓습니다. 교정 실행을 시작합니다. 시딩된 세포를 포함하는 마이크로플레이트를 인큐베이터로부터 꺼내십시오.
세포를 교란시키지 않고, 웰 당 130 마이크로리터의 미리 가온된 글리코분해 스트레스 시험 분석 배지를 천천히 첨가하여 각 웰의 배지 부피를 180 마이크로리터로 구성하고, 플레이트를 추가로 15 내지 20분 동안 인큐베이터로 복귀시킨다. 소프트웨어에서 트레이 열기를 클릭하여 Seahorse의 열 트레이를 엽니 다. 교정이 끝난 후 유틸리티 플레이트를 세포가 포함된 이 분석 마이크로플레이트로 교체하고 로드 셀 플레이트를 눌러 측정을 시작합니다.
측정이 끝난 후, 세포를 방해하지 않고 플레이트로부터 분석 배지를 제거하고, 세포를 분해하지 않고 250 마이크로리터의 인산염 완충 식염수로 부드럽게 세척한다. 이제 1X 프로테아제 억제제 칵테일로 보충 된 10 마이크로 리터의 방사성 면역 침전 용해 완충액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 진탕기에서 10 분 동안 교반하십시오. 전체 접시를 영하 80도에서 얼립니다.
플레이트를 해동하고 제조업체의 지시에 따라 데이터 정규화를 위한 단백질 측정 분석을 수행합니다. Wave 데스크탑 소프트웨어를 사용하여 데이터 파일을 열어 데이터를 검색하고 분석합니다. 정규화를 클릭하고 각 웰의 정규화 값을 붙여 넣은 다음 적용을 클릭하여 데이터를 정규화하십시오.
내보내기를 클릭하고 당분해 스트레스 테스트 보고서 생성기를 선택하여 분석된 데이터를 보고서 생성기로 내보냅니다. 비글리콜성 산성화율은 세포 수가 50, 000에서 250, 000으로 증가하면서 상승하지만, 200, 000에서 250, 000 사이에서만 최소한으로 증가한다. 10 밀리몰 글루코스의 주입은 웰 당 250, 000 세포에서 관찰되는 ECAR의 최대 증가와 함께 모든 세포 수에서 당분해를 자극합니다.
그러나, 올리고마이신의 두 마이크로몰의 주입은 ECAR을 더 증가시키지 않는다. 동일한 글리코분해 스트레스 테스트 세트에서 얻어진 OCR 데이터는 복합 5 억제로 인한 올리고마이신 주사 후 유의한 감소를 보여준다. 글리코분해 스트레스 테스트 파라미터를 계산하고, 추가 연구를 위해 올리고마이신의 두 마이크로몰에서 웰당 250, 000개의 세포를 선택하였다.
미토콘드리아 스트레스 테스트는 두 마이크로몰 올리고마이신 주사가 콤플렉스 5의 억제를 통해 OCR의 현저한 감소를 야기한다는 것을 보여주었다. FCCP는 두 마이크로몰에서 관찰되는 최대 증가로 용량 의존적 방식으로 HSPCs의 OCR을 자극한다. 0.5 마이크로몰 로테논과 0.5 마이크로몰 안티마이신 A 주사의 혼합물은 OCR을 비미토콘드리아 산소 소비에 상응하는 최소 수준으로 감소시킨다.
미토콘드리아 스트레스 테스트 파라미터를 계산하고 추가 연구를 위해 FCCP의 두 마이크로몰을 선택하였다. 이 기술의 높은 처리량 특성을 감안할 때, 여기에 기술된 프로토콜은 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 인자 및 악성 조혈 세포에서 많은 수의 생물에너지 조절제를 스크리닝하도록 쉽게 적응될 수 있다. 해마 분석은 다양한 기질 및 억제제의 존재하에 다양한 맥락에서 신진 대사를 측정하기 위해 문헌에서 널리 사용됩니다.
